Las orquídeas conforman una de las familias más diversas que existen, con un número estimado entre 25 y 30 mil especies silvestres y varios miles de híbridos tanto naturales como artificiales (^{Dressler, 1981}; ^{Beutelspacher, 2012}). En México se conocen alrededor de 1260 especies de la familia Orchidaceae (^{Hágsater et al., 2005}) y se estima que alrededor del 40% son endémicas. Las enfermedades producidas por virus ocupan el segundo lugar de los problemas fitosanitaros (^{Arauz, 1998}) y ya que las orquídeas son plantas herbáceas longevas las hace más propensas a infecciones virales. Dado que las orquídeas pueden alcanzar altos precios y en ocasiones ser ejemplares muy raros, hace que aun plantas infectadas por virus no sean eliminadas y con ello se incremente el riesgo de contagio a las demás. Actualmente se han registrado por lo menos 30 especies de virus que infectan orquídeas, algunos de estos se pueden transmitir por vectores como el Tomato spotted wilt virus (TSWV) (^{Lawson, 2002}), pero los más comunes, transmitidos mecánicamente y por material propagativo, son Cymbidium ringspot virus (Tombusvirus), Odontoglossum ringspot virus (ORSV) y Cymbidium mosaic virus (CymMV) (^{Freitas-Astúa, 2003}). El CymMV y ORSV son los de mayor importancia económica ya que reducen el crecimiento y floración (Lawson, 2002) y en México se han reportado en invernaderos comerciales infectando algunos géneros (^{López-Hernández et al., 2014}). Actualmente, en el Orquideario de Miguel Ángel Soto Arenas (Orquideario MAS), de la Facultad de Ciencias UNAM, se han observado plantas de diversos géneros de orquídeas con síntomas característicos de infecciones virales. Muchas de estas plantas tienen valor histórico, hortícola, científico o biológico, y por lo tanto no pueden ser sacrificadas, pero tienen que ser diagnosticadas para su manejo adecuado. Por lo que el objetivo de este trabajo fue determinar el o los virus asociados a estos síntomas mediante pruebas de ELISA, RT-PCR y plantas diferenciales, describirlos en los géneros de orquídeas que no han sido reportados como hospedantes en México y, mediante un análisis filogenético, determinar si la infección procede de géneros nativos.

Del 22 al 24 de abril de 2018, en el Orquideario MAS se realizó una colecta dirigida de tejido vegetal (hojas, raíces y flores) de plantas con síntomas de variegado, clorosis y manchas necróticas foliares; dichas plantas se marcaron y fotografiaron. En total se recolectaron 47 muestras de distintas plantas. Las muestras se etiquetaron y transportaron en una hielera al laboratorio de virus del Colegio de Postgraduados para procesadas. De estas se seleccionaron 12 provenientes de las plantas con síntomas más evidentes y se procedió a realizar la extracción de RNA total con CTAB (^{Sambrook y Rusell, 2001}) a partir de 100 mg de tejido vegetal. La integridad de las extracciones se corroboró mediante electroforesis y la concentración se cuantificó en el Nanodrop^®. Se realizaron las retrotranscripciones con cebadores generales para detectar algunos de los géneros de virus fitopatógenos más comunes. Para Potexvirus se utilizaron los cebadores Potex1RC, Potex5 y Potex2RC descritos por ^{Van der Vlugt y Berendesen (2002}), para Tospovirus los cebadores BR60 y BR65 descritos por ^{Eiras et al. (2001}), para Potyvirus los cebadores NIb2F y NIb3R descritos por ^{Zheng et al. (2010}) y para Tomabovirus se utilizaron los cebadores TobRTup1 y TobRTdo2 descritos por ^{Dovas et al. (2004}). Se siguieron las condiciones generales de amplificación y la concentración de reactivos recomendado por cada descriptor de los cebadores generales. Los productos esperados de PCR se purificaron con el kit comercial Wizard^® y se secuenciaron en Macrogen. Las secuencias se editaron con el programa BioEdit^® y se compararon con las reportadas en el GenBank. Las secuencias consenso se registraron en el GenBank y con estas se realizó el análisis filogenético con el método de máxima verosimilitud (ML) basado en el modelo de Kimura-2 parámetros, con distribución Gamma discreta con 5 categorías, utilizando el sofware libre MEGA7. Para la comparación, se eligieron diferentes secuencias del CymMV y ORSV procedentes de Costa Rica, Taiwán, Japón, Francia, Corea y Nueva Zelanda, disponibles en la base de datos del NCBI.

La ELISA se hizo con anticuerpos policlonales específicos, positivos y negativos de ORSV y CymMV (Agdia^®) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se maceraron 300 mg de tejido vegetal en 3 mL de buffer de extracción. Cada una de las 47 muestras se analizó por duplicado para asegurar la confiabilidad del diagnóstico. Se obtuvo la densidad óptica a 405 nm (OD405) de las muestras en un lector de placas de ELISA. Para el análisis mediante plantas indicadoras, tejido vegetal positivo a CymMV y ORSV se maceró por separado en tampón de fosfatos para inocular mecánicamente plantas de Nicotiana tabacum var. xhanti, N. glutinosa, N. clevelandii, N. benthamiana, N. occidentalis, N. virginiana, N. rustica, Chenopodium quinoa., C. amaranthicolor y Datura stramonium. Se inocularon en total tres plantas de cada especie por virus y, como testigo, se tuvo una planta de cada especie frotada con agua.

Durante el recorrido en el Orquideario MAS se encontraron plantas con un ligero mosaico, con coloración moteada púrpura, o con clorosis generalizada, acompañada de manchas necróticas (Figura 1). Solo en pocas especies del género Barkeria se observó además variegado en flores.

Estos síntomas corresponden a los reportados por virus en orquídeas (mosaico, anillos cloróticos, deformación, variegado y manchas necróticas) (^{Albouy y Devergne, 2000}; ^{López-Hernández et al. 2014}), pero la expresión de estos es muy variable y su severidad dependerá del aislamiento del virus, el hospedante y las condiciones ambientales (^{Agrios, 2005}). Generalmente una alta temperatura y luminosidad prevaleciente en los invernaderos favorecen la multiplicación de los virus y la mezcla de infección por CymMV y ORSV incrementará la severidad (^{Yamane et al., 2008}). En plantas positivas a ORSV no se observaron anillos cloróticos, pero se sabe que la aparición de éstos depende del tiempo que tengan las plantas con la infección y de las condiciones ambientales (Yamane et al., 2008).

De las retrotranscripciones se obtuvieron amplicones del fragmento esperado con los cebadores para Potexvirus (584 pb) y Tobamovirus (568 pb). Los análisis para Tospovirus y Potyvirus fueron negativos y solo se amplificaron las muestras control (RNA de planta infectada con TSWV y RNA de planta infectada con Papaya ringspot virus) (imágenes no mostradas). La secuenciación demostró que el amplicón de 568 pb tuvo una similitud del 99% con Odontoglossum ringspot virus (KF85954.1), y se detectó en ocho de las 12 muestras analizadas (Figura 2, izquierda). La secuenciación del fragmento de 584 pb tuvo una similitud del 98% con Cymbidium mosaic virus (AJ270986.1) y se detectó en solo dos muestras (Figura 2, derecha).

Figura 1 Síntomas observados durante el muestreo. Variegado en flores y coloración púrpura en Barkeria scandens (A) y Barkeria whartoniana (B). Mosaico y lesiones necróticas en Cattleya lobata (C). Clorosis en Dendrobium híbrido tipo nobile (D). Lesiones necróticas coalescentes en Sobralia macrantha (E). Coloración púrpura en Leochilus cro codiliceps (F), Clorosis en Masdevalia floribunda (G). Bandeado clorótico y manchas necróticas en Rossioglossum Random Chester (H), Manchas necróticas en Epidendrum jamiesonis (I), Manchas necróticas en Oesrtedella sec. Epidendrum macdougallii (J). Mosaico en Guarianthe ×guatemalensis (K). Bandeado clorótico y manchas necróti cas Lycaste virginalis (L). 

La secuencia consenso, aislado M48 (número de acceso: MK908224), de CymMV se agrupó con un aislamiento de CymMV de Holanda (AJ270986.1), se separó de los aislados de Costa Rica, Francia y Hawaii, y se relacionó con los aislamientos de Japón y Corea (Figura 3 derecha). Dos secuencias consenso de los aislamientos M10 y M4 (números de acceso: MK902741 y MK902742) de ORSV se agruparon con aislamientos de ORSV procedentes de Corea y Taiwán (Figura 3 izquierda). Hasta la fecha no se conocen casos de infecciones naturales de virus en orquídeas silvestres, por lo que el origen de estos virus es incierto (^{Kull et al., 2009}). El agrupamiento de los aislamientos de CymMV y ORSV del presente estudio con aquellos reportados en Corea, Japón y Taiwán y alejados de los encontrados en Costa Rica, sugiere que la infección pudo deberse al intercambio entre material vegetal común en el turismo de orquídeas (^{Pickering y Ballantyne, 2013}) y no a la existencia de estos virus en los ecosistemas mexicanos.

Figura 2 Electroforesis en gel de agarosa al 1% de productos de RT-PCR para detectar en plantas al Odontoglossum rings pot virus (izquierda) y al Cymbidium mosaic virus (derecha). 1 Barkeria whartoniana, 2 Lycaste híbrido, 3 B. skin neri, 4 B. scandens, 5 Bardendrum tanzanita, 6 Laelia anceps, 7 Laelia lobata, 8 Lycaste virginalis, 9 Masdevallia barlaeana, 10 Laelia anceps Mendehell, 11 Sobralia macrantha, 12 Encyclia spp. 1Kb: marcador molecular de 1 kilobase; (-): agua libre de nucleasas. (+): planta infectada con Tobacco mosaic virus.  

Mediante el análisis por DAS-ELISA, se detectó en 29 plantas al ORSV, en cuatro sólo a CymMV, en nueve se encontraron ambos virus y en cinco no se detectaron estos virus (Cuadro 1). En México el ORSV no se había detectado hasta el momento en especies de los géneros Barkeria, Lycaste, Rossioglossum, Masdevallia, Leochilus, Stanhopea, Maxillaria y Oerstedella (Epidendrum); y el CymMV en los géneros Dendrobium, Sobralia y Cuitlauzina. Se encontró una mayor incidencia del ORSV que del CymMV en las plantas muestreadas, y a pesar de que todas las muestras provenían de plantas con síntomas, algunas fueron negativas; esto pudo deberse a que la concentración viral de la muestra tomada no fue lo suficientemente alta para que alguno de los virus se detectara por ELISA. En general se dice que el CymMV es más estable que ORSV y es el de mayor prevalencia (^{Khentry et al., 2006}), pero en investigaciones similares con Phalaenopsis también detectaron en mayor proporción al ORSV que al CymMV (^{Yamane et al., 2008}). Esto puede explicarse por la procedencia de las plantas ya que se sabe que el CymMV no se transmite por semilla a diferencia del ORSV (^{Pradhan et al., 2016}); pero se desconoce si las plantas muestreadas en la presente investigación fueron generadas o no a partir de semilla.

Figura 3 Representaciones de las relaciones filogenéticas entre las secuencias de los fragmentos obtenidos con los iniciado res Potex5/Potex2cr para Cymbidium mosaic virus (derecha), y Tob Rtup1/TobRTdo2 para Odontoglossum rings pot virus (izquierda), usando el método molecular ML (Maximum Likelihood), basado en el modelo Kimura 2-parámetros y un bootstrap de 1000. 

En las plantas indicadoras se observaron lesiones locales necróticas en Nicotiana tabacum var. xhanti y lesiones locales cloróticas en N. glutinosa, C. quinoa, C. amaranthicolor y Datura stramonium seis días después de la inoculación (ddi) con ambos virus (Figura 4A-C). En hojas de Datura stramonium y N. occidentalis inoculadas con material vegetal positivo solo para CymMV se observaron anillos cloróticos mientras que en N. benthamiana ocasionó infección sistémica consistente en deformación de hojas y necrosis de nervaduras (Figura 4D-F). En las plantas testigo no se observaron síntomas.

Figura 4 Plantas inoculadas con ORSV a los 6 días después de la inoculación (ddi): lesiones locales necróticas en N. taba cum var. xhanti (A); lesiones locales cloróticas en C. quinoa (B) y C. amaranthicolor (C). Plantas inoculadas con CymMV a los 17 ddi: anillos cloróticos en D. stramonium (D) y N. occidentalis (E), infección sistémica en N. ben thamiana (F). 

Las plantas indicadoras más usadas para diagnosticar al CymMV son N. benthamiana, Cucumis sativus, D. stramonium, Gomphrena globosa y C. amarticolor (^{Brunt et al., 1996}) y, con base en los resultados del presente estudio, es posible utilizar también a N. glutinosa y N. occidentalis. Se ha corroborado que C. quinoa y C. amaranticolor son mejores hospedantes para ORSV y Datura stramonium para CymMV, aunque no hay selectividad (^{Cánovas et al., 2016}); sin embargo, en esta investigación se observó diferencia en los síntomas ocasionados por CymMV y ORSV en D. stramonium, ya que el primero provocó lesiones cloróticas anilladas mientras que el segundo ocasionó lesiones cloróticas de menor tamaño. El aislamiento de CymMV ocasionó infección sistémica en N. benthamiana y se sabe que existen aislamientos de este virus que son capaces de infectar o no sistémicamente a esta planta (^{Hsiang-Chia et al., 2009}).

En este trabajo se reporta por primera vez en México la presencia de ORSV y CymMV en diversos géneros de orquídeas con especies mesoamericanas. Algunas especies están amenazadas según la NOM-ECOL-059-2010, como Barkeria scandens, B. skinneri, B. whartoniana, C. pendula, E. adenocaula, L. dawsonii, L. gouldiana, L. virginalis (= L. skinneri), S. tigrina y V. planifolia; y otras son especies raras o que están sujetas a una alta tasa de recolecta ilegal, y pronto pueden figurar en las listas de especies en riesgo de extinción, como B. spectabilis, E. magnificum, L. autumnalis, L. furfuracea, O. reicheinheimii, O. Oliganthum, entre otras (^{Damon, 2017}).

Se agradece a la M. en C. Patricia Olguín y al estudiante de licenciatura Cekouat León por su asistencia en el mantenimiento de la colección de orquídeas. A la DGAPA UNAM por el financiamiento (PAPIIT IN227319).