Artículos

 

Inducción a la tetraploidía en almeja catarina, Argopecten ventricosus (Sowerby II, 1842)

 

Induction to tetraploidy in catarina scallop, Argopecten ventricosus (Sowerby II, 1842)

 

Rosalío Maldonado, Ana M. Ibarra* y José L. Ramírez

 

Laboratorio de Genética Acuícola, Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C., Apartado postal 128, La Paz, CP 23000, Baja California Sur, México. *E-mail: aibarra@cibnor.mx

 

Recibido en agosto de 2002;
aceptado en febrero de 2003.

 

Resumen

La inducción a la tetraploidía por inhibición de la extrusión del primer cuerpo polar en huevos producidos por diploides y fertilizados por esperma haploide produjo un porcentaje reducido de larva-D tetraploide, pero no resultó en la presencia de semilla o adultos tetraploides. La inhibición de la primera división celular del cigoto resultó principalmente en larva anormal. Cuando la inducción a la tetraploidía se realizó inhibiendo el primer cuerpo polar en huevos de triploides fertilizados con esperma haploide, se obtuvo un alto porcentaje de larva-D tetraploide en una de las inducciones. De las progenies tetraploides, seis sobrevivieron hasta talla adulta. El análisis de hemolinfa, por medio de citometría de flujo, de los supervivientes indicó que cinco eran tetraploides y uno era mosaico (2n y 4n). Con base en estos resultados, los esfuerzos futuros para la producción de tetraploides de almeja catarina deberán de centrarse en la utilización de ovocitos de triploides (fecundados con esperma haploide), inhibiendo el primer cuerpo polar.

Palabras clave: almeja catarina, Argopecten ventricosus, tetraploide, poliploide.

 

Abstract

Induction to tetraploidy by inhibition of the first polar body and first cellular division in fertilized eggs from diploids produced an occasional small percentage of tetraploid D-larvae, but was not successful in multiple experiments with individual or combined spawns in producing juvenile or adult tetraploids. However, when inhibition of the first polar body in eggs from triploids was done, a larger percentage of tetraploids was evidenced by flow cytometry of D-larvae, and viable larvae were obtained in one out of six induced batches. Six individuals survived to pre-adult size, five being tetraploids and one a mosaic (diploid-tetraploid). Based on these results, further efforts in producing tetraploid catarina scallop should be centered on the method involving inhibition of the first polar body in eggs from triploids, fertilized with haploid sperm.

Key words: scallop, Argopecten ventricosus, tetraploid, polyploid.

 

Introducción

La inducción a la poliploidía en moluscos es una realidad en nuestros días, especialmente cuando se considera a la triploidía. Los moluscos triploides se caracterizan por presentar un mejor crecimiento o calidad de carne que los diploides. Esto se debe principalmente a que la condición del triploide resulta en una esterilidad parcial o total, de tal forma que la energía disponible para la formación de gametos y la maduración de los mismos puede ser utilizada en el crecimiento (Allen y Downing, 1986). Uno de los problemas de esta tecnología es que, para la producción de triploides, se tienen que utilizar métodos de inducción ya sean químicos o físicos, los cuales resultan, ambos, en una mortandad alta de los huevos sometidos a estos tratamientos. Una alternativa para obtener organismos triploides para la producción de moluscos en cultivos es por medio de la utilización de apareamientos "naturales" entre organismos tetraploides y diploides (Guo et al., 1996). Debido a que los organismos tetraploides no existen en forma natural entre los moluscos, tienen que ser producidos primero de manera artificial.

La producción de tetraploides ha demostrado ser difícil, aunque algunos se han producido en forma accidental al inhibir la extrusión del primer cuerpo polar en huevos de diploides (Stephens y Downing, 1988; Diter y Dufy, 1990; Gendreau y Grizel, 1990; Guo et al., 1992; Scarpa et al., 1993; Allen et al., 1994; Cai y Beaumont, 1996; Yang et al., 2000; Zhang et al., 2000). La ploidía esperada cuando se inhibe el primer cuerpo polar en huevos de diploides fertilizados con esperma haploide es un cigoto triploide. Por ello, cuando se observan tetraploides se suponen consecuencia de un evento aleatorio raro, como la segregación de los cromosomas en un arreglo tri y unipolar (en contraste con uno bipolar), en donde un juego completo de cromosomas es liberado en el segundo cuerpo polar y tres juegos completos son retenidos. Ocasionalmente, también cuando se inhibe el primer cuerpo polar, se han observado progenies pentaploides (Cooper y Guo, 1989; Diter y Dufy, 1990; Scarpa et al., 1993; Yang et al., 2000), lo cual es una consecuencia de la inhibición no inducida del segundo cuerpo polar, adicionalmente al primer cuerpo polar inducido.

Mientras que en plantas la obtención de tetraploides provocados por la inhibición de la primera división celular con colchicina se ha logrado con éxito (Norstog y Long, 1976; Klug y Cummings, 1996; Gardner et al., 1998; Tamarin, 1999), los intentos de producir tetraploides de moluscos por inhibición de la primera división celular no han mostrado resultados satisfactorios (Diter y Dufy, 1990; Guo, 1991, citado por Guo y Allen, 1994; Guo et al., 1994; Yang et al., 1997). Solamente una metodología (Guo y Allen, 1994) ha demostrado su factibilidad en la producción de tetraploides viables de ostión japonés. Ésta consiste en la utilización de huevos producidos por triploides, los cuales son fecundados con esperma haploide, inhibidos en la extrusión del primer cuerpo polar, pero permitiendo la liberación del segundo cuerpo polar. En huevos de triploides la segregación de cromosomas en la meiosis I es impar, resultando en aneuploidía. Al inhibir la meiosis I, la probabilidad de una segregación balanceada en la meiosis II se incrementa ya que la división que ocurre en la meiosis II es de tipo equitativo, en donde todos los cromosomas duplicados se alinean en la metafase y, al separarse los centrómeros, una de cada una de las cromáticas hermanas segrega al segundo cuerpo polar, reteniendo el ovocito tres juegos completos de cromosomas. Un ovocito que contribuye con tres juegos cromosómicos cuando es fecundado con un esperma haploide resultará en un cigoto tetraploide, como ha sido demostrado que ocurre en el ostión japonés (Guo y Allen, 1994) y en la ostra perlera asiática (He et al., 2000).

En la almeja catarina la triploidía ha sido inducida en forma exitosa, encontrándose una ventaja significativa en el crecimiento del triploide cuando se compara con el diploide, especialmente cuando se considera la parte comercial de esta especie, esto es, el músculo aductor o callo que, en el triploide fue del doble del observado en el diploide (Ruiz-Verdugo et al., 2000). Asimismo, se ha observado que la esterilidad en la gónada femenina es parcial (Ruiz-Verdugo et al., 2000), de tal manera que al menos un 20% de los ovocitos en un diploide pueden ser obtenidos en desoves inducidos en triploides (Ruiz-Verdugo et al., 2001). Estos ovocitos pueden ser utilizados para la evaluación de la producción de almeja catarina tetraploide, a través de la utilización del método desarrollado por Guo y Allen (1994) para el ostión japonés.

En este estudio reportamos los resultados sobre la inducción a la tetraploidía en almeja catarina Argopecten ventricosus Sowerby II, 1842, utilizando tres métodos diferentes: inhibición del primer cuerpo polar e inhibición de la primera división celular, en huevos de diploides, así como inhibición del primer cuerpo polar en huevos de triploides fecundados con esperma haploide.

 

Materiales y métodos

Reproductores y recolección de gametos

Las almejas catarina diploides y triploides, con una longitud aproximada de 7 cm, fueron acondicionadas para el desove siguiendo la metodología de Ramírez et al. (1999). Ésta consiste en proveer alimentación continua con un sistema de riego por goteo adaptado para este fin. Las almejas diploides alcanzaron la madurez después de 15 días, mientras que las triploides tardaron de 20 a 21 días. La madurez fue evaluada por medio de la escala visual de Sastry (1963), en la que se reconocen cuatro estadios: inmaduro, madurez parcial (tanto la sección femenina como masculina son identificadas fácilmente por su coloración, pero la gónada aún presenta espacios), maduro (la gónada se observa "llena", con una coloración naranja-rojo brillante), y desovado. Los procedimientos de inducción al desove y la recolección de gametos fueron los mismos para todos los experimentos. El desove se indujo inyectando intramuscularmente 0.2 mL de una solución de serotonina al 0.5 mM. En esta especie hermafrodita funcional, la serotonina induce la liberación del esperma primero, seguido por el huevo. Una vez que las almejas iniciaron la liberación del huevo, éstas fueron enjuagadas con agua de mar y colocadas en vasos (1 L) individuales para la recolección del huevo.

En todas las inducciones a la poliploidía se utilizó citocalacina-B (CB) (Sigma C-6762), enjuagando después del tratamiento con DMSO (dimetil-sulfóxido a una concentración igual a la de la CB utilizada en esa inducción) durante 15 min para retirar la CB excedente (Allen et al., 1989). La concentración de CB utilizada por litro varió entre inducciones y se indica en la descripción de cada experimento.

Eventos meióticos evaluados para la inducción a la tetraploidía

• Inhibición del primer cuerpo polar (meiosis I) en huevos de diploides: En este método, el tratamiento con CB se inició de 5 a 6 min después de la fertilización, y se concluyó cuando los primeros huevos en un grupo control mostraron la extrusión del segundo cuerpo polar (2CP). Esto correspondió a cuando el 70% de los huevos en el control mostraron la extrusión del primer cuerpo polar (1CP).

• Inhibición de la primera división celular (mitosis) en cigotos diploides: El tratamiento se inició cuando el 50% de los huevos en el grupo control mostraron la extrusión del 2CP, y se concluyó cuando 50% de los cigotos en el grupo control estaban en la primera división celular (1DC).

• Inhibición del primer cuerpo polar en huevos de triploides fertilizados con esperma haploide: El tratamiento se inició 5 min después de la fertilización, y se concluyó cuando del 50% al 70% de los huevos en el grupo control mostraron la extrusión del 1CP.

Experimentos

Todos los experimentos descritos a continuación se hicieron utilizando agua de mar filtrada mediante filtros de polipropileno hasta 1 µm, y esterilizada con luz UV (180 W). La salinidad fue de 36 ppm y la temperatura de 21.5°C a 22°C, mantenida utilizando un sistema de enfriamiento comercial que trabaja por recirculación a una cisterna de 7000 L. El volumen de agua utilizado para los diferentes tratamientos con CB fue siempre de 250 mL, independientemente del número de huevos obtenido en cada experimento. Este volumen optimiza la cantidad de CB utilizada, y ha sido utilizado previamente con inducciones por individuo en esta especie con resultados satisfactorios (Ruiz-Verdugo et al., 2001).

En el experimento I, los huevos de siete almejas se mantuvieron en forma individual, conformando siete réplicas. Cada réplica fue dividida en dos: un grupo control no tratado (aproximadamente 1/3 del total de huevos por hembra), y un grupo para la inhibición de la 1DC (el resto de los huevos obtenidos de cada hembra, aproximadamente 2/3) utilizando 0.5 mg CB L^-1. El número de huevos desovado por hembra varió de 448,000 a 1,683,000. En aquellas réplicas en las que se observó larva normal en el grupo control, se estimó el porcentaje de cada clase de ploidía (diploide, triploide, tetraploide, pentaploide) resultante por citometría de flujo, siguiendo los procedimientos descritos por Allen y Bushek (1992). En resumen, las larvas fueron concentradas en una suspensión de agua de mar de 1 mL, centrifugadas y teñidas con 0.5 mL de una solución de DAPI/detergente/DMSO. La concentración de DAPI en esa solución fue de 10 µg mL^-1. Posteriormente, las larvas fueron desagregadas macerando conchas y tejido. La suspensión de células obtenida fue filtrada en una malla con abertura diagonal de 30 µm, agregando 1.5 mL de la solución de DAPI/detergente/DMSO 5 min antes de la lectura por citometría de flujo (Ploidy Analyzer II, Partec, Alemania). Adicionalmente, para estimar el porcentaje de células en cada clase de ploidía se establecieron límites mínimos y máximos para cada clase. El límite mínimo se estimó como la media de esa ploidía menos tres desviaciones estándar y, el límite máximo, como la media más tres desviaciones estándar.

En el experimento II se evaluaron cuatro repeticiones. Cada repetición se conformó por el total de los huevos producidos por seis almejas. El propósito de este experimento fue definir si se podía producir almeja catarina tetraploide en forma alterna a la inhibición de la 1DC, esto es, utilizando ahora la inhibición del 1CP y comparando con los resultados obtenidos al inhibir la 1DC. Basándonos en los datos de número de huevos desovados por hembra en el primer experimento, que indicó que éste puede ser tan bajo como 450,000, en el experimento II se utilizó un pool de huevos, ya que se requeriría dividir los huevos en tres grupos. Cada repetición se dividió en tres grupos: control (no tratado), inhibición del 1CP (0.75 mg CB L^-1) e inhibición de la 1DC (0.5 mg CB L^-1). El número de huevos varió entre repeticiones, dependiendo del número de huevos desovado por las seis hembras que conformaron cada repetición. En la repetición 1 se obtuvieron un total de 9,334,900 huevos, en la repetición 2, un total de 5,962,000 huevos, en la 3 un total de 4,941,000 huevos, y en la 4 un total de 4,095,000 huevos. En las repeticiones en las que se obtuvo larva normal en los grupos controles, se estimaron los porcentajes de ploidía que ocurrieron en cada grupo, analizados como en el experimento I.

En el experimento III se evaluaron cinco repeticiones, cada una formada al combinar los huevos de tres a cuatro almejas. El pool se utilizó por las mismas razones explicadas para el experimento anterior. El objetivo principal de este experimento fue evaluar si la inhibición del 1CP resultaba en diferencias en la ploidía lograda, con respecto a la inhibición del 2CP, cuando en ambos casos se utilizaron 0.5 mg CB L^-1. Cada repetición se dividió en tres grupos: control (no tratado), inhibición del 1CP e inhibición del 2CP. El número de huevos obtenido por repetición varió de 1,145,000 a 3,284,000. Independientemente del número total de huevos por repetición, aproximadamente 10% de los mismos fueron destinados al control, 45% para inhibición del 1CP y 45% para inhibición de 2CP. La ploidía resultante en las repeticiones que presentaron larva normal en los controles se analizó por citometría de flujo tanto en larva-D como en algunas de las semillas logradas (repetición 2 de las que presentaron larva normal en el control). Para semilla, el análisis de citometría de flujo se hizo de acuerdo con el método de Allen (1983) y Allen y Bushek (1992), analizando cada semilla en forma individual. El número de semillas analizadas fue de 20 para el grupo control, 68 para las inhibidas en el 1CP y 20 para las inhibidas en el 2CP.

El experimento IV se llevó a cabo para evaluar la inducción a la tetraploidía al inhibir el 1CP en huevos de triploides fertilizados con esperma haploide. De 144 almejas triploides, 19 fueron seleccionadas, por observación macroscópica, por la presencia del mayor número de huevos en la gónada; 6 de las 19 almejas desovaron. El número de huevos obtenido por almeja triploide fue de 446,000, 382,000, 536,000, 332,000, 244,000 y 526,000 para las almejas 1 a la 6, respectivamente. Los huevos se mantuvieron en forma individual. Cada desove se dividió en dos grupos: una muestra de 1/4 del total para un control que permitiera establecer tiempos de eventos meióticos, y el resto (3/4) de los huevos de cada almeja triploide fueron tratados con 0.5 mg CB L^-1, siguiendo la metodología de Guo y Allen (1994) para inducir tetraploidía en ostión, e introduciendo las sugerencias de Eudeline et al. (2000) para incrementar el éxito. El tratamiento de los huevos con CB se inició 5 min después de la fertilización, y se concluyó cuando del 50% al 70% de los huevos en el grupo control de ese desove mostraron la extrusión del 1CP. La ploidía resultante en larva-D de los seis desoves inducidos fue analizada como en los otros experimentos. Para aquellos organismos que alcanzaron tallas mayores (preadultos), la ploidía se analizó extrayendo de 0.1 a 0.3 mL de hemolinfa del músculo aductor de cada almeja con una jeringa de 1 mL. La repetición 5 fue la única que produjo semilla y preadultos. Las células obtenidas se tiñeron con 1.5 mL de la misma solución de DAPI/ detergente/DMSO ya antes mencionada durante 5 min y se analizaron por citometría de flujo.

 

Resultados

La inhibición de la 1DC resultó en 100% de larva-D anormal, no viable, independientemente del experimento. El uso de desoves individuales en el experimento I no tuvo mayor éxito que cuando se usaron desoves mezclados en el experimento II, en cuanto a la supervivencia a larva-D, cuando se inhibió la 1DC. Asimismo, cuando se inhibió el 1CP en ovocitos de diploides, el porcentaje de larva-D anormal fue de 95% a 100%, con una sola excepción en el experimento III en la que se obtuvo solamente un 70% de larva anormal (repetición III.2). La inhibición del 2CP resultó en 50% a 100% de larva-D anormal dependiendo de la repetición. Estas anormalidades en la larva-D se manifiestan principalmente por la forma de la concha, la cual se observa con una forma redondeada más que con la forma normal en D a la que atribuye su nombre.

En el experimento I, la supervivencia media hasta el estadio larva-D de los huevos inhibidos en la 1DC, con relación al control, fue cero. En el experimento II, la supervivencia media de los huevos inhibidos en la 1DC, así como en el 1CP fue también nula. En el experimento III la supervivencia media hasta larva-D, con relación al control, fue de 1.3% para los inhibidos en 1CP y de 18.3% para los inhibidos en el 2CP.

Ploidía estimada por citometría de flujo

En larva-D obtenida en los experimentos I a III

La ploidía obtenida en estos experimentos se resume en la tabla 1. La inhibición de la 1DC con el propósito de producir tetraploides no tuvo éxito. Al inhibir la 1DC, las ploidías resultantes más comunes fueron diploides y triploides aunque, en forma general, la inhibición de la 1DC resultó en larva hipo y hiperploide, lo cual se evidenció por la ausencia de un pico de fluorescencia definitivo durante la citometría de flujo, especialmente cuando se compara con los resultados de citometría observados para el grupo control. La inhibición del 1CP produjo desde larva diploide hasta pentaploide, habiendo obtenido tetraploides en tres de cinco de los desoves inducidos. Únicamente se observó larva pentaploide cuando se inhibió el 1CP. El éxito en la producción de triploides al inhibir el 1CP fue menor que el alcanzado al inhibir el 2CP.

En semilla obtenida del experimento III

La ploidía estimada para la semilla superviviente del tratamiento de inhibición del 1CP fue de 18% de triploides y 82% de diploides. No se detectaron tetraploides a esta edad, a pesar de los que fueron detectados durante el estadio larva-D. Para la semilla superviviente del tratamiento de inhibición del 2CP, la ploidía fue de 80% de triploides y 20% de diploides. En el grupo control sólo se detectaron diploides.

En larva-D y en la hemolinfa de los adultos producidos en el experimento IV

La ploidía resultante al inhibir el 1CP en huevos de triploides se presenta en la tabla 2. Solamente uno de los desoves inducidos (hembra 5) produjo un alto porcentaje de tetraploides (59%), mientras que los otros desoves variaron en el éxito en la producción de tetraploides (10% a 26%). El desove de la hembra 5 produjo 6000 larvas-D, de las cuales solamente 17 llegaron a semilla. De esas semillas, solamente seis almejas sobrevivieron hasta una talla de preadulto (2.5 cm). El análisis de hemolinfa por citometría de flujo de esas seis almejas indicó que cinco eran tetraploides y una era mosaico de diploide-tetraploide. Los análisis de citometría de estas almejas se realizaron en forma repetida, separados por ocho días, encontrándose lo mismo en ambas evaluaciones.

 

Discusión

Nuestros resultados han demostrado que se puede inducir la tetraploidía en la almeja catarina, A. ventricosus, utilizando citocalacina-B para inhibir la liberación del 1CP en huevos de almejas diploides y triploides. Sin embargo, de acuerdo con estudios previos desarrollados en otras especies, los tetraploides producidos al inhibir el 1CP en diploides no alcanzan a sobrevivir hasta la talla de semilla o adulto, mientras que los producidos por la inhibición del 1CP en huevos de triploides son viables hasta tallas adultas. La tecnología para la producción de moluscos tetraploides utilizando este último método fue desarrollada por Guo y Allen (1994) para el ostión japonés, Crassostrea gigas, y se ha demostrado que es factible para lograr la producción de larva tetraploide también en otra especie, la ostra perlera, Pinctada martensii (He et al., 2000). Con el presente estudio se ha demostrado que el uso de esta tecnología es factible en tres especies de moluscos. Su uso permitirá eliminar la dependencia de métodos de inducción (química o física) a la triploidía, permitiendo la conformación de los denominados triploides biológicos de almeja catarina, tal y como como se ha logrado para el ostión japonés (Guo et al. , 1996), eliminando dos factores de riesgo durante la producción de triploides: alta mortandad por la inducción y bajo éxito en el porcentaje de triploides logrados.

La ocurrencia de tetraploides cuando se inhibe el 1CP con el fin de producir triploides (ver introducción) se considera un evento azaroso y, por lo tanto, no es de esperarse la ocurrencia del mismo en todas las inhibiciones del 1CP. Para entender este fenómeno son necesarios más estudios a nivel citológico y cromosómico. Por otro lado, las variaciones en ploidía observadas entre las repeticiones de los diferentes experimentos en los que se inhibió el 1CP en ovocitos de diploides pueden ser explicadas como un posible efecto de diferencias en las tasas meióticas de los ovocitos utilizados entre repeticiones. El éxito en la inhibición de eventos meióticos depende de la sincronización en el desarrollo de los huevos, la cual depende a su vez de la calidad de los gametos (Gerard et al., 1999). Esto es, se sabe que la tasa meiótica es afectada por la condición de madurez del ovocito utilizado, observándose una asincronía en eventos meióticos entre ovocitos incluso cuando son del mismo origen, pero el método de obtención varía entre las hembras (Coates y Supan, 2000). La importancia de la calidad del huevo en las inducciones a la poliploidía fue denotada primero por Utting y Doyou (1992), quienes demostraron que la existencia de variación en la calidad del huevo de la almeja Manila, Ruditapes philippinarum, podía afectar el éxito en obtener la triploidía, y que esto es causado por una falta de sincronía en las tasas meióticas.

En relación con la falta de éxito en la producción de tetraploides directamente de diploides, ésta ha sido reportada para diferentes especies como R. philippinarum (Diter y Duffy, 1990), C. gigas (Guo, 1991, citado por Guo y Allen, 1994; Guo et al., 1994) y Chlamys azumapecten (Yang et al., 1997). Guo (1991, citado por Guo y Allen, 1994) propuso que la causa de la inviabilidad de tetraploides producidos directamente de huevos de diploides puede estar asociada con el tamaño del huevo y con las reservas energéticas existentes para el desarrollo y multiplicación de un cigoto diploide en comparación con un tetraploide, así como también el tamaño del núcleo que no es capaz de permitir la alineación correcta del doble de cromosomas durante la metafase. Esto podría explicar los resultados observados cuando se inhibió la 1DC con el fin de producir tetraploides, en donde se observó un desarrollo de larvas anormales que, en su mayor parte, no alcanzaron la talla de semilla. En contraste, cuando se inhibió el 1CP en huevos de triploides, los organismos tetraploides producidos si fueron viables, aunque en números reducidos. El tamaño del ovocito de un diploide vs el de un triploide de la almeja catarina ha sido documentado previamente para esta especie (Ruiz-Verdugo et al., 2001). El diploide presenta un ovocito de aproximadamente 38 µm de diámetro, mientras que el diámetro del ovocito del triploide es mayor, de 43 µm. Estas diferencias se traducen en que el ovocito del triploide tiene un volumen 55% mayor que el de un diploide, lo cual posiblemente resulta en una mayor cantidad de reservas energéticas. Más aun, el tamaño del núcleo de un ovocito de triploide es 109% mayor que el de un diploide, lo cual permitiría la alineación de todos los cromosomas durante la metafase

En conclusión, nuestros resultados reafirman las observa- ciones previas de otros autores acerca de la producción de tetraploides en moluscos, la cual no es factible a partir de diploides, así como también corroboran la factibilidad de la metodología desarrollada por Guo y Allen (1994) para la producción de tetraploides a partir de triploides, indicando con ello que los esfuerzos futuros dirigidos a la producción de tetraploides en moluscos deberán centrarse en esa metodología.

 

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por CONACYT, al proyecto 28256-B de A.M. Ibarra. Agradecemos el apoyo de Susana Ávila en los análisis de citometría de flujo, y el apoyo técnico de Gabriel González y Juan M. Macliz durante el cultivo larvario. El primer autor es estudiante de doctorado, becado por CONACYT y SEP (DECYTM), y los resultados presentados son parte de su tesis.

 

Referencias

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