En el género Pouteria se encuentran especies con alto potencial frutícola, entre las cuales se incluye al zapote mante, amarillo o canistel (P. campechiana). Su origen es el sur de México y Centro América. En México, su producción y comercialización va en aumento, su consumo es regional como alimento fresco o bien para fabricar alimentos procesados, obtener aceites para industria de cosméticos y como medicina. Esta zapotacea se produce en el municipio de El Mante, Tamaulipas; en donde se observaron frutos con manchas hundidas que provocan pudrición. No se sabe a partir de cuándo se presentó la enfermedad, ni el patógeno que la induce. El objetivo de esta investigación fue identificar al agente causal, mediante pruebas de patogenicidad, características morfológicas y pruebas moleculares.

En un huerto no comercial, en Ciudad Mante, municipio de El Mante, Tamaulipas, México, se colectaron 30 frutos de zapote mante; los cuales, presentaron manchas hundidas de color marrón a negro (1-3 cm de diámetro) en gran parte del epicarpio y que al tiempo coleasen. Los frutos se desinfestaron con una solución de hipoclorito de sodio al 1% durante 3 min, y se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril. Enseguida, se colocaron en cámara húmeda a 27 °C y cuando se observó la esporulación, las estructuras fungosas se colocaron sobre una placa de papa dextrosa agar (PDA 39 g L^-1 de agua). Este procedimiento se realizó para cada fruto colectado, obteniéndose un total de 180 aislamientos, los cuales se mantuvieron en placas de PDA a 27 °C en oscuridad total.

La descripción morfológica de los aislamientos se realizó con preparaciones temporales, y permanentes, se observaron bajo microscopio las estructuras fungosas y se midieron al menos 50 veces cada una de ellas, posteriormente para la determinación del género se siguieron las claves de ^{Barnett y Hunter (1998)} y ^{Bensch et al. (2012)}. Con base en estas claves los aislamientos obtenidos se denominaron MTCc (144 aislamientos), MTCO (22 aislamientos) y MT1 (14 aislamientos).

En las pruebas de patogenicidad solo se utilizaron los aislamientos MTCc y MTCO (tratamientos) y en cada caso se utilizó el morfotipo con mayor frecuencia. Se inocularon 40 frutos maduros de zapote mante, asintomáticos, los cuales se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 1% y se enjuagaron con agua destilada estéril. Se evaluaron dos niveles de inóculo, 1 x 10⁶ y 1 x 10⁴ conidios por mL para inocular dos grupos de 20 frutos. La suspensión de conidios se obtuvo a partir de cultivos monospóricos de los aislamientos MTCc y MTCO, respectivamente. En los frutos de cada tratamiento se produjeron pequeñas heridas con una aguja estéril, a las que se les asperjaron tres mL de la suspensión de conidios; de igual manera a los 20 frutos testigo se les produjeron pequeñas heridas con una aguja estéril y se les asperjó agua destilada estéril. Los 60 frutos de cada tratamiento se colocaron en una cámara húmeda a 27 °C durante 12 días, tiempo en el cual se registró el desarrollo de síntomas en los frutos; cuando estos fueron evidentes, se realizaron aislamientos de micelio crecido en el síntoma. Este experimento se repitió una vez más. Cabe señalar que en ambos ensayos el aislamiento denominado MTCO y el tratamiento testigo no indujeron ningún síntoma en los frutos inoculados. En contraste, el aislamiento MTCc con cada nivel de inoculó indujo síntomas muy similares a los observados en campo. Los reaislamientos obtenidos se denominaron MTCc-pp, se mantuvieron en placas de PDA a 27 °C en oscuridad total.

Para la caracterización molecular del aislamiento MTCc y de los aislamientos obtenidos de la prueba de patogenicidad (MTCc-pp); se extrajo el ADN genómico total. Se utilizaron 200 mg de micelio crecido durante cinco días en medio líquido PD (papa dextrosa) mantenido en un termo agitador a 112 rpm. Los 200 mg de micelio se incubaron por 1 h a 60 °C en 1,000 µL de buffer de extracción (NaCl 0,7 M, Tris 0,1 M pH 7,5, 0,01 M EDTA pH 8,0, 1% ß-ME, y 1% CTAB) agitando moderadamente cada 5-10 min. Posteriormente se le adicionó 200 µL de NaAc 3 M, y se colocó a -20 °C durante 20 min, seguido de una centrifugación a 10,000 rpm por 10 min. Para la precipitación del ADN se tomaron 750 µL del sobrenadante y se colocó en un tubo nuevo de 1,5 mL, enseguida se añadieron 750 µL de isopropanol frio y se mantuvo a -20 °C por 20 min. Una vez transcurrido este tiempo, se centrifugó por 10 min a 12,000 rpm, se desechó el sobrenadante, la pastilla se lavó tres veces con 100 µL de etanol frío al 70%, se secó a temperatura ambiente y se resuspendió en 30 µL de agua libre de ADNsas. Finalmente, el ADN se almacenó a -20 °C.

En la reacción en cadena de la polimerasa se usaron los iniciadores universales ITS1F (5´- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA -3´) e ITS4R (5´- TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3´). La mezcla para PCR con un volumen final de 25 µL, consistió en agua libre de ADNsas, buffer de reacción 1X, MgCl₂ 2,5 mM, dNTP´s 2 mM, 1U de Taq ADN polimerasa (Promega^®), iniciadores 1 pmol y 100 ng/µL de ADN, con las siguientes condiciones de amplificación: un ciclo a 94 °C por 5 min, 30 ciclos a 94 °C por 30s, 55 °C por 30s y 72 °C por un min. Los productos de amplificación se visualizaron en gel de agarosa al 1% + bromuro de etidio, en un fotodocumentador Gel-Doc 2,000. Posteriormente, el producto de PCR de los aislamientos MTCc y MTCc-pp se purificaron con el kit Wizard^® SV gel and PCR Clean-up System (Promega) y se secuenciaron en un secuenciador automático de ADN de 16 capilares (Applied Biosystems, modelo 3130xl).

Las secuencias obtenidas se ensamblaron en el programa Mega 7, en donde se realizó una limpieza para corregir los posibles errores de secuenciación, posteriormente se alinearon para obtener una secuencia consenso de 572 pares de bases, la cual se comparó con secuencias reportadas en la base de datos del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI) mediante la herramienta Blast. Enseguida, se hizo un análisis filogenético usando el método Neighbor-Joining con 5,000 réplicas de bootstrap.

De los aislamientos obtenidos, se identificaron dos hongos: Colletotrichum sp. (MTCO) y Cladosporium sp. (MTCc) y un tercero que produjo un estroma esclerosado (MT1), el cual no fue identificado. Cladosporium sp. fue el que se presentó con mayor frecuencia con un 8.5% de asociación con las lesiones de la enfermedad. Los aislamientos de Cladosporium sp., presentaron características culturales similares, consistentes con las reportadas para este género (^{Bensch et al., 2012}). En el microscopio compuesto se observó la presencia de conidióforos cilíndricos macronematosos nodulosos alejados entre sí, con una sola célula conidiogénica, los conidios presentan uno o ningún septo y midieron de ancho 3 a 5 μm, siendo estas características las reportadas para C. cladosporioides (^{Bensch et al., 2012}).

En las pruebas de patogenicidad, con los dos niveles de inóculo evaluados, se observaron zonas hundidas en el epicarpio 48 h después de la inoculación. A las 72 h, en las zonas hundidas se observaron manchas de color marrón que posteriormente se necrosaron y coalescieron en el fruto. Sobre las manchas, se desarrolló micelio de color blanco que presentaba estructuras morfológicas muy similares a las del aislamiento MTCc. Los reaislamientos obtenidos coincidieron con las características culturales y morfológicas de dicho aislamiento, demostrándose así que esta originaba la mancha hundida en frutos de zapote mante (Figura 1).

Figura 1 Caracterización morfológica y pruebas de patogenicidad de Cladosporium cladosporioides en frutos de zapote mante (Pouteria campechiana) en Ciudad Mante, Tamaulipas, México. A) Fruto con manchas hundidas de color marrón; B) Aislamiento MTCc; C y D) Conidióforos macronematosos nodulosos y conidios elipsoidales de Cladosporium cladosporioides. E-I) Pruebas de patogenicidad; E) Fruto utilizado como testigo; F) Fruto inoculado con zonas hundidas de color marrón; G) Presencia de estructuras morfológicas del aislamiento MTCc en fruto inoculado; H) Reaislamiento obtenido de fruto inoculado en pruebas de patogenicidad; I) Conidióforos y conidios de Cladosporium cladosporioides.  

Las secuencias obtenidas se analizaron con la herramienta BLAST del NCBI, en donde se observó un 99% de similitud con secuencias reportadas de Cladosporium cladosporioides. La secuencia del aislamiento MTCc se depositó en el GenBank (número de acceso KP788715). En el análisis filogenético se comprobó la identidad del aislamiento MTCc al establecer una estrecha relación con aislamientos reportados como Cladosporium cladosporioides.

Los síntomas observados, coinciden con los descritos para Cladosporium cladosporioides afectando mandarina (Citrus reticulata), papaya (Papaya carica), maracuyá (Passiflora edulis), y mango (Mangifera indica L.) (^{Guillen-Sánchez et al., 2007}; ^{Vásquez et al., 2012}; ^{Tashiro et al., 2013}) demostrando el impacto de este patógeno en diferentes frutales, al disminuir su valor comercial debido a la apariencia desagradable del epicarpio. Hasta donde se conoce este es el primer reporte en México de Cladosporium cladosporioides causando manchas necróticas en frutos de zapote mante.