nueva página del texto (beta)
Español (pdf)
Artículo en XML
Referencias del artículo
Traducción automática
Enviar artículo por email
Citado por SciELO 
Similares en
SciELO 
Permalink
Introducción
Castilleja tenuiflora Benth. (Orobanchaceae) es una planta hemiparásita conocida en la medicina tradicional mexicana como: cola de borrego, calzón de indio, garañona, garayona, hierba del golpe o hierba del cáncer (Martínez, 1994). Su importancia en la medicina tradicional está fundamentada en la producción y acumulación de compuestos químicos que le confieren un valor farmacológico como sedante, anti-ulcerogénico, citotóxico y anti-inflamatorio. Estos compuestos activos son lignanos, feniletanoides (verbascósido e isoverbascósido), flavonoides (apigenina) e iridoides glicosilados (Herrera-Ruíz et al. 2015; Sánchez et al. 2013; Gómez-Aguirre et al., 2012; López-Laredo et al., 2012; Martínez-Bonfil et al., 2011; Moreno-Escobar et al., 2011).
Dada la importancia etnobótanica que tiene C. tenuiflora existe un interés por establecer un sistema de micropropagación con fines de conservación del germoplasma y para obtener un modelo de estudio que permita realizar investigación sobre la formación de raíces y haustorios. Los reportes sobre conservación del germoplasma en condiciones in vitro han involucrado para su establecimiento medios de cultivo como el B5 suplementado con ácido indolacético (AIA) para inducir la formación de raíces (Gómez-Aguirre et al., 2012). Los resultados indican un mayor rendimiento en biomasa y cambios morfológicos en las raíces después de la transferencia a un medio de cultivo sin reguladores de crecimiento. Estos cambios se relacionaron con la presencia en las raíces laterales de C. tenuiflora de algunos abultamientos de forma redonda. Estas estructuras se asemejan a haustorios, órganos que desarrollan las especies hemiparásitas y cuya función es ser un puente de conexión entre la planta parásita y su hospedero, con el fin de obtener agua, nutrientes y diferentes tipos de metabolitos. Bajo condiciones in vitro se ha reportado la inducción de haustorios con compuestos químicos como vanillina, H2O2 y catequina (Salcedo-Morales et al., 2014), o 2,6-dimetil-p-benzoquinona y antocianinas (Albrecht et al., 1999). Estos compuestos son del tipo de los que encuentran en la rizósfera, por lo que se conocen como exudados de raíz y son los responsables de la formación de haustorios de manera natural (Walker et al., 2003; Hassan et al., 2004). En condiciones in vitro Tomilov et al. (2004) reportaron la inducción de haustorios en presencia de AIA (0.228 µM) en plantas de Triphysaria versicolor (Orobanchaceae), mientras que Montes-Hernández et al. (2015) señalaron que, a partir del haustorio, C. tenuiflora obtiene agua, compuestos fijadores de carbono, nitrógeno y nutrientes.
La inducción de haustorios en condiciones in vitro se ha llevado a cabo para conocer más sobre las relaciones parásitas que afectan una gran cantidad de cultivos de importancia económica (Deeks et al., 1999). Sin embargo, la relación entre la formación de haustorios y el desarrollo de raíces no ha sido reportada. En condiciones in vitro C. tenuiflora presenta dificultades para desarrollar raíces, y cuando lo hace, estas son pequeñas y delgadas lo cual es un obstáculo para la micropropagación y subsecuentemente la aclimatación ex vitro. Por lo anterior, el objetivo de este trabajo fue promover la generación de raíces e inducir la fo cuando lo hace, estas son pequeñas y delgadas lo cual es un obstáculo para larmación de haustorios en plántulas de C. tenuiflora cultivadas in vitro, para su caracterización morfológica e histoquímica, empleando catequina y H2O2 con dos medios de cultivo; SH y B5.
Material y métodos
Estrategia experimental
Para lograr la formación de raíces e inducción de haustorios y poder caracterizarlos, se hicieron crecer plántulas de C. tenuiflora de 21 días de edad en condiciones in vitro. Se probaron dos diferentes medios de cultivo y también dos distintos tipos de compuestos formadores de haustorios (CFHs), lo anterior según los siguientes cuatro tratamientos: Plántulas con medio B5; Plántulas con medio B5 mas catequina (25 µM); Plántulas con medio SH y Plántulas con medio SH mas H2O2. Las variables de respuesta para todos los tratamientos fueron: Numero de raíces formadas por cada plántula, grosor de la raíz y numero de haustorios presentes por raíz. Se realizaron dos experimentos independientes con dos replicas cada uno (n = 4). El análisis estadístico de los datos se realizo con el software SigmaStat® y consistió en un análisis de varianza seguido de una prueba de comparación de medias de Tukey (α = 0.05).
Material biológico y condiciones de cultivo
Plantas de C. tenuiflora cultivadas in vitro se desarrollaron durante 21 d en medio de cultivo líquido SH o B5 suplementados con 30 g/L de sacarosa y 10 µM de AIA. Los cultivos se mantuvieron en agitación a 110 rpm, en condiciones controladas de fotoperiodo (16 h luz/8 h oscuridad) a 70 μmol/m2s de intensidad luminosa y a 25 ± 2oC de temperatura. Después de ese periodo de crecimiento, en condiciones asépticas se subcultivaron en los medios de cultivo sin reguladores de crecimiento. Para los tratamientos los CFHs fueron previamente esterilizados por filtración a través de membranas de nylon de 0.2 µm (Millipore, GNP, Irlanda) y las plántulas estuvieron en contacto con los CFHs durante 21 d. Para la identificación y caracterización de raíces y haustorios, se utilizó una tinción con cristal violeta y las raíces fueron observadas con un microscopio estereoscópico (modelo MZ 1500, Nikon, Japón) equipado con una cámara digital.
Análisis histológico de haustorios
El análisis histológico se realizó de acuerdo a lo reportado por Bancroft y Gamble (2002). Las raíces fueron fijadas con formaldehido durante 24 h, posteriormente se realizaron tres lavados con amortiguador de fosfatos pH 7.2 (0.2 M) para eliminar los restos de formaldehido y evitar dañar el tejido. El siguiente paso fue deshidratar las raíces utilizando etanol en diferentes concentraciones: 30%, 50%, 70%, 80%, 90% y etanol absoluto durante 1 h en cada una. Estas raíces se colocaron en una solución de xilol-etanol (50-50%, v/v) durante 1 h, y se transfirieron a xilol al 100% (v/v) durante 24 h. Posteriormente, se pasaron a una solución xilol-paraplast (50%-50%, v/v) por 24 h y se colocaron en paraplast al 100% durante 1 h. Finalmente, las raíces fueron colocadas de manera individual en contenedores simport con tapa en forma de rejilla (Sigma/Aldrich, St. Louis, MO, EU) colocándoles el paraplast hasta quedar completamente cubiertas y colocarles una rejilla que permitió que las raíces quedaran inmovilizadas. Las muestras se secaron durante 24 h en un horno a 60oC y se refrigeraron a 4oC para que solidificaran. Se realizaron cortes de 10 µm en un microtomo (LEICA, RM2125RT, Alemania), se tiñeron con el colorante cristal violeta y fueron observadas en un microscopio de luz (modelo Eclipse 801, Nikon, Japón) equipado con cámara digital.
Resultados
Desarrollo de raíces de C. tenuiflora
Se observaron cambios morfológicos en las raíces de C. tenuiflora cultivadas in vitro y estos se relacionaron tanto con el medio de cultivo utilizado, así como con la presencia de los CFHs suplementados en los tratamientos. Las raíces que se desarrollaron en los tratamientos control, crecidas en medio de cultivo B5 y SH (fig. 1A y 1B respectivamente), fueron de tipo axonomorfas, es decir, de la raíz principal emergen raíces delgadas y lisas. Por su parte los tratamientos a los que se aplicaron los CFHs desarrollaron más raíces, con respecto a los demás tratamientos, y estas fueron más gruesas (fig. 1C, 1D y 1F). Los tratamientos de C. tenuiflora desarrollados en el medio B5 ó SH con la aplicación de catequina desarrollaron un mayor número de raíces (cuadro 1), en comparación con el control y el tratamiento con en el mismo medio, pero con H2O2. En particular, con el tratamiento del medio de cultivo B5 + catequina (fig. 1C) se obtuvieron raíces de C. tenuiflora en las que se aprecia la formación de haustorios y la presencia de pequeñas raíces delgadas (pelos haustoriales).
Fig. 1. Plántulas de C. tenuiflora. (A) Raíces de plantas crecidas en medio de cultivo B5 (control). (B) Raíces de plantas crecidas en medio de cultivo SH (control). (C) Raíces de plantas crecidas en medio de cultivo B5 +catequina. (D) Raíces de plantas crecidas en medio de cultivo SH+catequina. (E) Raíces de plantas crecidas en medio de cultivo B5 + H2O2. (F) Raíces de plantas crecidas en medio de cultivo SH +H2O2. Las flechas indican la presencia de haustorios.
Cuadro1. Inducción de haustorios, número y grosor de raíces en plantas de C. tenuiflora aplicando catequina y H2O2 como CFHs.
| Tratamiento | Número de raíces | Grosor (mm) | Haustorios/raíz |
|---|---|---|---|
| B5 | 3 - 4 ± 2.4B | 0.37 ± 0.1B | 0 - 1 ± 0.5B |
| + catequina | 6 - 7 ± 1.4B | 0.75 ± 0.3A | 1 - 2 ±1.7B |
| + H2O2 | 1 - 2 ± 1.5B | 0.46 ± 0.3B | 2 - 3 ±1.1A |
| SH | 2 - 3 ± 2.5B | 0.45 ± 0.3B | 0 |
| + catequina | 8 - 9 ± 2.6A | 0.70 ± 0.2A | 2 - 3 ± 1.5A |
| + H2O2 | 3 - 4 ± 0.9B | 0.41 ± 0.3B | 0 - 1 ± 0.7B |
Los datos representan la media ± el error estándar de la media, de dos experimentos independientes (n = 4), letras diferentes en cada columna indican diferencia significativa de acuerdo con una prueba de Tukey (α = 0.05).
En el tratamiento con el medio de cultivo SH + catequina se obtuvieron plantas que presentaron entre 8 y 9 raíces, seguido por el tratamiento con medio B5+ catequina con 6-7 raíces, mientras que en los controles, medio B5 y SH, se obtuvieron entre 3-4 y de 2 a 3 raíces, respectivamente. Por su parte las plantas crecidas en los medios de cultivo B5 + H2O2 y SH + H2O2, generaron de 1 a 2 y de 3 a 4 raíces, respectivamente.
La catequina tuvo un efecto significativo sobre el grosor de las raíces de C. tenuiflora, independientemente del medio de cultivo utilizado. El grosor de estas prácticamente se duplicó alcanzando valores de 0.75 mm con B5+catequina y 0.70 mm con SH+catequina respectivamente, mientras que los cultivos con H2O2 y control generaron raíces con valores de entre 0.37 mm y 0.45 mm de grosor (cuadro 1).
Formación y caracterización histológica de haustorios en plantas de C. tenuiflora
El medio de cultivo tuvo efecto en la formación de haustorios, en la figura 2A se muestran raíces de C. tenuiflora crecidas en medio de cultivo B5 sin CFHs, en donde se observa tanto el inicio de la formación de raíces (flecha blanca), como el inicio de la formación de haustorios (flecha roja), mientras que con el medio de cultivo SH sin CFHs no se indujo la formación de haustorios (fig. 1E y cuadro 1). Por otro lado, la formación de haustorios si se presentó cuando se aplicaron los CFHs independientemente del medio de cultivo utilizado (figs. 2A y 2D). Al respecto, se encontró que el número de haustorios/raíz fue mayor con B5 + H2O2 y SH + catequina (2-3 haustorios), en comparación al control (medio B5 sin CFHs) con el que se obtuvo solo un haustorio por raíz (cuadro 1).
Fig. 2. Raíces y haustorios de plántulas de C. tenuiflora. (A) Formación de raíces (flecha blanca) y desarrollo de haustorios (flecha roja). (B-C) Corte histológico de un haustorio de raíz teñido con cristal violeta. (D). Desarrollo de haustorios (flecha roja) en raíces (E). Corte histológico de una raíz con haustorio teñidos con cristal violeta, mostrando la formación de un haustorio y la zona meristemática (ZM). En B y E, tejidos que forman un haustorio, (a) Tejido dérmico, (b) tejido fundamental, (c) tejido vascular y (d) tejido vascular de raíz.
En los cortes histológicos de raíz de C. tenuiflora crecida en medio de cultivo B5 se observa el abultamiento de la epidermis de la raíz, debida al alargamiento de las células que posteriormente darán lugar a la emergencia de una raíz secundaria desde la zona del periciclo (fig. 2A). Mientras que en la figura 2C, se puede observar la presencia de gránulos de almidón (flecha blanca), los cuales se utilizan como fuente de energía en el proceso de enraizamiento y formación del haustorio.
En contraste, en la figura 2B y 2E se muestra un corte longitudinal de un haustorio de raíz de C. tenuiflora crecida en medio de cultivo SH + H2O2, la formación del haustorio se caracteriza por el alargamiento de las células de la epidermis de la raíz, así como por la formación de una zona meristemática, dando lugar a la formación de una zona de abultamiento en la que se identifica la presencia de tejido dérmico (a), tejido fundamental (b), tejido vascular (c) y tejido vascular de la raíz (d).
Discusión
Un aspecto importante en la micropropagacion in vitro a partir de brotes es la formación de raíces adventicias. Al respecto, en este estudio se probaron el efecto del medio de cultivo y CFHs en plántulas de C. tenuiflora sobre la formación de raíces y generación de haustorios. Los resultados muestran que hay una variación entre los diferentes tratamientos (cuadro 1). Esta diferencia puede deberse a diversas razones, como la síntesis de auxinas, su transporte o la aplicación exógena de estas (De Klerk et al., 1999). Los tratamientos con H2O2 resultaron en una menor cantidad de raíces, lo anterior a pesar de ser una molécula que puede participar en procesos como gravitropismo de la raíz o desarrollo de raíces laterales, y que funciona tanto como un mensajero en la formación de raíces adventicias mediada por auxinas o como un mediador de los eventos responsables del enraizamiento adventicio (Huang, 2011). Sin embargo, el H2O2 es también una molécula que contribuye al estrés oxidativo, fenómeno común en plantas, y es posible que en este caso los brotes de C. tenuiflora hayan priorizado el activar su sistema de protección antioxidante para reducir los niveles de H2O2 y esto no permitió su participación en la rizogénesis (Cheniany et al., 2010).
Por otro lado, los mejores resultados se presentaron con los tratamientos donde se agregó catequina como CFHs (cuadro 1). Resultados similares han sido reportados en Eucaliptus gunni (Curir et al., 1990) y en Chamelaucium uncinatum (Curir et al., 1993), quienes relacionan la capacidad de generación de raíces con la presencia de compuestos fenólicos. Esto se explica por el hecho de que los compuestos fenólicos protegen a las auxinas de la descarboxilación promoviendo una mayor disponibilidad de estas para la inducción de raíces (De Klerk et al., 2011). En este sentido, es posible que la catequina pueda estar participando en la protección de las auxinas y con ello promover la formación de raíces, obteniéndose de 6-7 raíces con un grosor de 0.75 mm con B5 + catequina y de entre 8-9 raíces con un grosor de 0.70 mm con SH + catequina.
Por su parte, los CFHs que se aplicaron a plantas de C. tenuiflora desarrolladas in vitro, tuvieron un efecto positivo sobre la formación de haustorios (cuadro 1). El desarrollo de haustorios de raíz en plantas hemiparásitas ha sido inducido en condiciones in vitro utilizando CFHs o exudados de raíz, este comportamiento esta reportado para Triphysaria versicolor en donde utilizan vanillina, 2,6-dimetoxi-p-benzoquinona y peonidina como CFHs (Albrecht et al., 1999) y para Agalinis purpurea en donde se aplicaron exudados del hospedero (Riopel y Musselman, 1979). Lo expuesto anteriormente coincide con los resultados obtenidos en este trabajo, en donde se promovió la inducción de haustorios con la adición tanto de catequina como de H2O2. Nuestros resultados concuerdan con lo descrito por Baird y Riopel (1984) quienes reportaron la formación de hasta 5 haustorios/planta inducidos con goma tragacanto. Por su parte, Montes-Hernández et al. (2015) reportaron una mayor cantidad de haustorios (hasta 10 haustorios por raíz) en raíces de plantas silvestres de C. tenuiflora, sin embargo esta cantidad la relacionan con la influencia que tiene el hospedero sobre C. tenuiflora y el estado vegetativo de esta.
Las observaciones histológicas permitieron identificar que los haustorios desarrollados in vitro presentan tres tipos de tejido: dérmico, fundamental y vascular, lo que concuerda con lo reportado por Montes-Hernández (2015) para haustorios de plantas silvestres de C. tenuiflora que están en interacción con raíces de Baccharis conferta. Este mismo autor también reporta la presencia de gránulos de almidón en el haustorio de C. tenuiflora silvestre, y esto también se encontró en los haustorios generados in vitro. Al respecto, se sabe que el almidón es utilizado como fuente de energía durante su crecimiento, así como para la formación de semillas por la planta parásita (Quing-Liang et al., 2011), sin embargo, se desconoce el uso que pueda tener cuando está en el haustorio.
Conclusiones
Los CFHs (catequina y H2O2) inducen la formación de haustorios en raíces de C. tenuiflora cultivadas in vitro. El análisis histológico de las raíces y de los haustorios permitió observar los cambios característicos desde su formación; iniciación de una raíz (desde el periciclo) y de las zonas de abultamiento, alargamiento de las células de la epidermis y la zona meristemática que conforman la estructura de un haustorio. Este trabajo proporciona información que podría favorecer la propagación de C. tenuiflora en condiciones ex vitro.
