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Las especies de Phytophthora tienen el potencial de causar enfermedades devastadoras en ecosistemas forestales y agrícolas (Erwin y Ribeiro, 1996), ya que tienen la capacidad de infectar un amplio rango de hospedantes, tal es el caso de P. cinnamomi que es capaz de causar daños en alrededor de 2000 especies de plantas (Hardham, 2005). Otro ejemplo es Phytophthora sojae, que afecta un rango de hospedantes muy amplio y causa pérdidas económicas de hasta 2 mil millones de dólares a nivel mundial (Tyler, 2007).
La presencia de oomicetes fitopatógenos en agua de irrigación ha sido ampliamente documentada (Hong y Moorman, 2005); específicamente, existen alrededor de 30 especies del género Phytophthora que han sido aisladas de cuerpos de agua superficial como ríos, canales de irrigación, aguas recicladas y reservorios (Hüberli et al., 2013; Zappia et al., 2014).
Las especies de Phytophthora requieren de ambientes acuáticos para desarrollar su ciclo de vida asexual y así dispersarse rápidamente mediante la formación de esporangios y zoosporas; por ello han sido aisladas con regularidad de canales de agua de irrigación, reservorios de agua y ríos (Sutton et al., 2009; Ghimire et al., 2009; Hulvey et al., 2010; Bienapfl y Balci et al., 2014). Algunos ejemplos de especies reportadas con este medio de diseminación son: P. cactorum, P. parasitica, P. citricola, P. gonapodyides y P. cambivora, aisladas de aguas de irrigación en el estado de Washington (Yamak et al., 2002). Recientemente una de las especies con mayor incidencia en aguas superficiales es la especie P. hydropathica (Brazee et al., 2016; Ghimire et al., 2011; Hulvey et al., 2010). En la mayoría de estos casos, la presencia de especies de Phytophthora en agua no se ha relacionado con la existenciadesíntomasodañosenhospedantesvegetales terrestres (Resser et al., 2011). En México se ha documentado la presencia de 17 especies de Phytophthora (Fernandez-Pavía et al., 2015); entre las más estudiadas se encuentran P. capsici, P. cinnamomi y P. infestans (Fernandez-Pavía et al., 2013). La identificación de estas especies se ha efectuado a partir de aislamientos obtenidos de plantas enfermas, principalmente de hortalizas.
Históricamente, las especies de Phytophthora han sido identificadas mediante características morfológicas; sin embargo, la identificación es difícil incluso para los expertos, debido a las similitudes de las características entre algunas especies. Actualmente, los análisis moleculares basados en el estudio del ADN, se han utilizado para caracterizar poblaciones de Phytophthora en campos agrícolas y en ecosistemas naturales (Blair et al., 2008; Grünwald et al., 2011). Las regiones del genoma más utilizadas para estos estudios son: la región espaciadora interna transcrita (ITS) (Blair et al., 2008) y algunos genes nucleares como el gen que codifica para el factor de elongación 1-α (TEF-1α) y el gen de la β-tubulina (Kroon et al., 2004).
Los objetivos de este estudio fueron identificar especies de Phytophthora en canales de irrigación del Valle de Culiacán, así como evaluar su patogenicidad en plantas de importancia hortícola en la región.
Materiales y métodos
Colecta de aislados
Los aislamientos de Phytophthora spp. se obtuvieron de 25 canales de irrigación del distrito 010 en el Valle de Culiacán durante el mes de enero del 2015 (Cuadro 1). Los sitios de muestreo fueron seleccionados al azar; las trampas utilizadas fueron bolsas de organza cerradas con hilo de nylon en la parte superior, lo que además sirvió para atar las trampas a un punto determinado en la orilla del canal (Figura 1). Las bolsas contenían 1 fruto de pera y 3 hojas de azalea, ambos sin ninguna muestra de daño o enfermedad, y se colocaron 2 bolsas en cada sitio de muestreo. El material vegetal fue lavado con agua corriente y desinfestado con etanol al 70 % durante 30 s antes de ser colocado en las trampas. Las trampas permanecieron en la superficie de los canales de riego durante 48 h (Bush et al., 2003). Posteriormente, las trampas se colectaron y se trasladaron al laboratorio. El aislamiento se realizó colocando pequeñas secciones de tejido vegetal infectado (Figura 2), en medio selectivo que contenía jugo V8 (200 mL/L), pimaricina 10 μg/L, ampicilina 200 μg/L, rifampicina 10 μg/L, pentacloronitrobenceno 25 μg/L e hymexazol 50 μg/L (V8-PARPH) (Jeffers, 1986). Las placas Petri se incubaron a temperatura ambiente (25±2 °C) durante 3 a 5 días. De las colonias en formación, se realizó la transferencia de puntas de hifas para la obtención de cultivos puros (Hajebrahimi y Banihashemi, 2011). Finalmente, los aislamientos se preservaron colocando 5-7 discos de micelio en crecimiento activo (5 mm de diámetro) en medio agar harina de maíz (CMA) en microviales con agua destilada estéril, éstos se almacenaron a 15 °C (Martin et al., 2012).
Cuadro 1. Sitios de muestreo en canales de irrigación en el valle de Culiacán, especies identificadas y accesiones de las secuencias depositadas en NCBI.
ND= No determinado
*El número de acceso corresponde a las secuencias obtenidas con los iniciadores ELONGF1/ELONGR1
Caracterización morfológica
Se indujo la producción de esporangios tomando secciones de aproximadamente 10 mm2 de colonias con crecimiento de 3 a 5 días en medio V8; posteriormente, se colocaron en placas Petri de 90 mm y se inundaron con agua de lluvia esterilizada. Las placas se mantuvieron a temperatura ambiente (25±2 °C) durante 24-48 h (Gallegly y Hong, 2008; Bienapfl y Balci, 2014). Los esporangios se observaron en un microscopio óptico marca Carl Zeiss Axiostar Imager A2 con cámara integrada y se midieron con el software ZEN 2012 Blue edition (Carl Zeiss).
Estructuras, tales como clamidosporas, hinchamientos hifales, anteridios, oogonios y oosporas se observaron en medio agar V8 clarificado (jugo V8 sometido a 4000 rpm durante 20 min) en cultivos de 1 mes de edad aproximadamente, incubados en oscuridad a 20 °C (Mitchell et al., 1992; Bienapfl y Balci, 2014). Para determinar la temperatura máxima de crecimiento se colocaron discos de 5 mm de diámetro con crecimiento activo en medio V8 y se incubaron a 30, 35 y 40 °C±1 °C.
Tipo de apareamiento. Los aislamientos se confrontaron con cepas de referencia de P. nicotianae de tipo de compatibilidad A1 y A2. Una sección de 5 mm de los aislados A1 y A2 de P. nicotianae se transfirieron a una placa Petri con agar V8 clarificado y un disco de 5mm de diámetro de cada uno de los aislados se colocó en el lado opuesto de la placa. Los cultivos se incubaron a 22 °C durante 3 semanas aproximadamente (Bienapfly Balci, 2014). Las características morfológicas y las dimensiones de los anteridios, los oogonios y las oosporas fueron registradas para la descripción de las especies. Las estructuras asexuales y sexuales fueron comparadas con una clave tabular de especies de Phytophthora (Martin et al., 2012).
Caracterización molecular
Se utilizaron aproximadamente 3 mg de micelio, el cual se desarrolló al colocar discos de agar V8 con crecimiento activo de 10 mm de diámetro de cada uno de los aislamientos en medio caldo de papa, y posteriormente colocado en agitación a 150 rpm. A partir del micelio producido, se realizó la extracción de ADN; para esto, se utilizó un amortiguador de digestión (Tris/HCl, 10 mM, pH 8.0; EDTA, 50 mM; SDS, 0.5 %; Triton X-100, 0.5 %; Tween 20, 0.5 %) y 2 μL de proteinasa K (20 mg/mL), seguido de una serie de lavados con cloroformo-alcohol isoamílico (Zelaya-Molina et al., 2011). Para la caracterización de los aislamientos, se utilizaron los iniciadores DC6 (5’-GAGGGACTTTTGGGTAATCA-3’) (Bonants et al., 1997) e ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) (White et al., 1990) para amplificar la región que flanquea el ITS de un tamaño aproximado de 1300 pb y los iniciadores ELONGF1 (5 ́-TCACGATCGACATTGCCCTG-3 ́) y ELONGR1 (5 ́-ACGGCTCGAGGATGACCATG-3 ́) que amplifican un fragmento aproximado de 970 pb de la región central del gen que codifica para el factor de elongación 1-α en la cual no se incluyen intrones (Kroon et al., 2004). La concentración final de la mezcla para la PCR, consistió de: amortiguador 1X, dNTPs 0.2 mM, cada iniciador a 0.2 mM, 1 unidad de ADN polimerasa, para un volumen final de 25 μL. Las condiciones de amplificación para los iniciadores DC6/ITS4 consistieron en: 94 °C durante 3 min, seguido de 30 ciclos de 94 °C por 1 min, 55 °C por 1 min y 72 °C durante 1 min y una extensión final de 72 °C por 10 min y para los iniciadores ELONF/ELONR consistieron en 95 °C durante 2 min seguidos de 35 ciclos de 95 °C por 1 min, 60 °C por 1 min y 72 °C por 1 min y una extensión final de 72 °C durante 10 min. Los productos de PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 1%, teñido con gel red (Biotium, USA) sometidos a 70 V durante 90 min. Posteriormente, los productos de PCR se purificaron mediante el kit wizard SV Gel and PCR CleanUp System (Promega, USA). Ambas cadenas del amplicón fueron secuenciadas en LANGEBIO, CINVESTAV, Irapuato. Las secuencias obtenidas se editaron para obtener secuencias consenso en el programa Bioedit (versión 7.2). Se compararon las secuencias de los aislamientos con secuencias de aislados tipo depositadas en la base de datos especializada de Phytophthora (www.phytophthoradb.org) o en NCBI para determinar el porcentaje de similitud.
Evaluación de patogenicidad
Las pruebas de patogenicidad se realizaron en hojas de chile Capsicum annum (híbrido 5810 Syngenta) y tomate Solanum lycopersicum (variedad Horus). Las hojas de chile y foliolos de tomate completamente desarrollados se lavaron con agua corriente, se secaron y se desinfestaron con etanol al 70 % durante 30 s. Posteriormente, cuatro hojas de cada material, en las que previamente se realizaron heridas con una aguja de disección estéril, se inocularon artificialmente en la parte abaxial colocando un disco con crecimiento activo de las dos especies de Phytophthora (5 mm de diámetro) de siete días de edad en medio PDA. Una hoja de cada planta evaluada se utilizó como testigo, en la cual se realizaron heridas y sólo se colocó un disco de medio de cultivo PDA. Todas las hojas fueron colocadas en una cámara húmeda a temperatura ambiente (25±2 °C) durante cinco días, tiempo durante el cual se registró diariamente la longitud del área necrosada en la hoja (Orlikowski et al., 2012).
Resultados y discusión
Un total de 29 aislados pertenecientes al género Phytophthora se obtuvieron a partir de infecciones en pera y hojas de azalea. De los 25 puntos de muestreo se obtuvieron aislados de Phytophthora en sólo 10 sitios de muestreo (Cuadro 1). De acuerdo a sus características morfológicas, los aislamientos se clasificaron en 2 grupos: un primer grupo de 18 aislamientos que produjeron esporangios sin papila, de formas variadas desde ovoides, globosas hasta obpiriformes con tamaño de 45.8-57.4 x 32.9-36.9 μm (Figura 3A), persistentes, con proliferación tanto interna como externa y con esporangióforos largos y simples; los aislamientos produjeron clamidosporas terminales (Figura 3D) e hinchamientos hifales de formas irregulares en cadena y/o en grupos (Figura 3C).
Estos 18 aislamientos fueron heterotálicos y formaron oosporas pleróticas de 24.9 μm de diámetro en promedio y oogonios de 27.6 μm, con anteridios anfíginos (Figura 3B). La reproducción sexual de los aislamientos ocurrió únicamente con el aislado de referencia P. nicotianae A2, lo cual indica que los aislamientos son de tipo de compatibilidad A1. La temperatura máxima de crecimiento de los aislamientos fue de 40 °C.
Figura 3. Estructuras morfológicas del aislado 3-1F3 de la especie P. hydropathica. (A) Esporangio no papilado, ovoide (B) Oospora plerótica con anteridio anfígino. (C) Hinchamientos hifales irregulares en grupo. (D) Clamidospora esférica y terminal. Barra=20 μm.
Estas características morfológicas concuerdan con las características de la especie Phytophthora hydropathica descrita en la clave propuesta por Martin et al. (2012); así como con la descripción realizada por Hong et al. (2010). Cabe mencionar que en esas dos descripciones de P. hydropathica se menciona que la especie Phytophthora parsiana presenta características morfológicas muy similares. Ambos investigadores las diferencian en base a la temperatura máxima de crecimiento, ya que P. hydropathica es capaz de crecer hasta 40 °C, mientras que P. parsiana no crece en temperaturas superiores a 37 °C; además, Martin et al. (2012) mencionan que P. parsiana no presenta clamidosporas, mientras que P. hydropathica si las produce.
Los 18 aislamientos con clamidosporas fueron de tipo de compatibilidad A1 cuando se confrontaron con cepas A1 y A2 de P. nicotianae; esto coincide con lo reportado por Hong et al. (2010), quienes reportan el tipo de compatibilidad A1 en P. hydropathica, por lo que posiblemente esta especie no se está reproduciendo de manera sexual y sobreviva por medio de clamidosporas. De acuerdo con la morfología observada, los 18 aislamientos con esporangios sin papila pertenecen a la especie Phytophthora hydropathica.
El segundo grupo compuesto por 11 aislamientos comparten características morfológicas que consisten en un patrón petaloide regular de crecimiento en medio de cultivo PDA, esporangios no papilados con forma globosa y ovoide principalmente de base cónica con tamaños de 25.3-42.7 x 18.702-31.5 μm (Figura 4A), persistentes, con proliferación (Figura 4B) tanto interna como externa y con esporangióforos simples; este grupo de aislamientos produjeron hinchamientos hifales (Figura 4C) y no produjeron clamidosporas. Los aislamientos en este grupo fueron heterotálicos, de tipo de compatibilidad A1 formando oosporas pleróticas con un diámetro de 25.2 μm en promedio y anteridios de tamaño de 12.25 μm (Figura 4D). En Michoacán, México se han detectado los dos tipos de apareamiento en esta especie (Mora, 2013), por lo que es probable que si se realiza un muestreo más extenso se encuentre el tipo de compatibilidad A2. Otra característica de este grupo de aislados es la temperatura máxima de crecimiento que fluctúa entre 35 a 37 °C.
Figura 4. Estructuras morfológicas del aislado 17-1F1 de la especie P. drechsleri. (A) Esporangio no papilado, ovoide y de base cónica. Barra = 50 μm. (B) proliferación extendida del esporangio. Barra = 50 μm. (C) hinchamientos hifales. Barra = 50 μm. (D) oospora plerótica con anteridio anfígino. Barra = 20 μm.
Al comparar estas características con las claves taxonómicas de Erwin y Ribeiro (1996) y de Martin et al. (2012) éstas corresponden a la especie Phytophthora drechsleri. Es importante señalar que en ambas claves se menciona una estrecha relación de esta especie con P. cryptogea, aunque cabe destacar que también se mencionan algunas diferencias entre ambas especies, una de las principales es la temperatura máxima de crecimiento, para P. cryptogea existen reportes que indican que no puede crecer a temperaturas de 35 °C o mayores (Perlerou et al., 2010; Kurtbetli, 2014) mientras que para P. drechsleri existen reportes que puede crecer incluso hasta 37 °C. Existen otras diferencias entre ambas, tal es el caso del tamaño de las oosporas y de anteridios, P. drechsleri produce oosporas de aproximadamente 25.6 μm, mientras que las oosporas de P. cryptogea son más pequeñas con tamaños de alrededor de 22 μm. Caso similar ocurre con el tamaño de los anteridios, en donde P. cryptogea presenta anteridios más grandes, pudiendo estos alcanzar hasta 19 μm de longitud, mientras que los anteridios de P. drechsleri alcanzan tamaños máximos de 14 μm. De acuerdo a las características morfológicas y a las claves taxonómicas se puede inferir que el grupo de 11 aislamientos pertenecen a la especie P. drechsleri.
Las reacciones de PCR con los iniciadores DC6-ITS4 con los aislamientos que pertenecen a la especie P. hydropathica amplificaron un producto de aproximadamente 1300 pb (Dato no mostrado) y con los iniciadores ELONF-ELONR un producto de 960 pb aproximadamente (Figura 5). Las secuencias consenso mostraron entre 96-98 % de similitud con la especie Phytophthora hydropathica (código PD_00342_ITS) en la base de datos especializados en Phytophthora (Phytophthoradb.org) para los iniciadores ITS y 99-100 % de similitud con la especie tipo de P. hydropathica reportada en NCBI para los dos tipos de iniciadores (EU583793 y GQ260061). Este análisis confirma que estos aislamientos pertenecen a la especie Phytophthora hydropathica.
Figura 5. Fragmento de ADN amplificado con los iniciadores ELONGF1/ELONGR1 en aislamientos obtenidos de agua de irrigación. Línea 1, marcador molecular de 1 Kb; Línea 2, agua; Línea 3, control negativo (C. gloeosporioides); Línea 4, control positivo (P. capsici); Líneas 5-15, aislamientos de la especie P. drechsleri; Líneas 16-20, aislamientos de la especie P. hydropathica; Línea 21, marcador molecular de 1 Kb; Líneas 22-34, aislamientos de la especie P. hydropathica.
P. hydropathica ha sido aislada con frecuencia de aguas superficiales (Bienaflp y Balci, 2014; Vitale et al., 2014; Copes et al., 2015), principalmente en los meses más cálidos (Copes et al., 2015) pudiendo soportar temperaturas de hasta 40 °C (Hong et al., 2010). También ha sido aislada de plantas enfermas de andrómeda japonesa (Pieris japonica) (Bienalpf y Balci, 2014) en viveros y en agua utilizada en la irrigación de viveros (Hulvey et al., 2010), y en plantas ornamentales de Viburnum tinus con síntomas de muerte regresiva (Vitale et al., 2014).
En los aislamientos de la especie P. drechsleri, las reacciones de PCR con los iniciadores DC6-ITS4 y ELONGF1-ELONGR1 amplificaron un producto de aproximadamente 1300 pb (Dato no mostrado) y 970 pb (Figura 5), respectivamente. Las secuencias consenso mostraron una homología de 97 % con respecto a los aislamientos reportados en el NCBI para la especie Phytophthora drechsleri (GU111627 y AY659550) confirmándose así la identidad de estos aislamientos. P. drechsleri se ha encontrado en agua de irrigación a diferentes profundidades; por ejemplo, Bush et al. (2003) encontró a esta especie en la superficie del agua de irrigación y a profundidades de 1 y de 1.5 m.
Dos especies de Phytophthora se aislaron de la superficie de 10 canales de irrigación del Valle de Culiacán; en el 40 % de los canales en donde se detectó la presencia de Phytophthora se encontró únicamente P. hydropathica, en el 30 % solamente P. drechsleri y en el 30 % ambas especies (Figura 6). P. hydropathica es considerada una especie nativa de ecosistemas fluviales (Hong et al., 2010) por lo que es muy común en este tipo de estudios encontrar una alta frecuencia de aislamientos de esta especie (Bienapfl y Balci, 2014; Brazee et al. 2016).
Figura 6. Distribución de P. hydropathica y P. drechsleri en canales de irrigación del Valle de Culiacán.
Las secuencias obtenidas con los iniciadores ELONGF1-ELONGR1 que corresponden a las secuencias del gen que codifica para el factor de elongación 1-α de ambas especies se depositaron en la base datos del NCBI (Cuadro 1).
En las pruebas de patogenicidad, los aislamientos representativos 13F2, 15-1F1, 3-2F1, 18-2F1, 16-2F1, 20-2F1, 15-2F3, 3-1F3, 16-1F2 y 16-1H2 de P. hydropathica causaron síntomas visibles de necrosis a las 48 h después de la inoculación en foliolos de tomate y en hojas de chile (Cuadro 2; Figura 7) en contraste con las hojas utilizadas como testigo, en donde no se observaron síntomas. Los aislados fueron más agresivos en hojas de chile, causando necrosis en toda la hoja (45 mm) 120 h después de la inoculación, mientras que en hojas de tomate la lesión mayor fue de 26 mm (Cuadro 2). Hong et al. (2010) mencionan como posibles hospedantes a chile, tomate y pepino; lo cual se confirmó en este estudio para los dos primeros, estos resultados muestran que P. hydropathica representa un riesgo para los cultivos de tomate y chile, que son de gran importancia en esta región. En estudios similares (Bienapfl y Balci, 2014; Brazee et al., 2016) se menciona que aunque P. hydropathica raramente se ha encontrado asociada a enfermedades en plantas, si posee el potencial para causar enfermedades.
Cuadro 2. Longitud de la lesión ocasionada por P. hydropathica y P. drechsleri en hojas de chile y foliolos de tomate.
hdi= horas después de inoculación; 45 mm= hoja completa.
Figura 7. Patogenicidad de P. hydropathica 3-1F3 en hojas de chile y foliolos de tomate 48 h después de la inoculación. (A) Hoja de chile inoculada. (B) Foliolo de tomate inoculado. (C) y (D) Hoja de chile y foliolo de tomate testigos.
Los aislados 16-1F3, 1-2H2, 17-1F1, 15-1F2, 23-1F1, 1-1H2, 11F2, 23-2F1, 23-1F3, 23-2F4 y 23-2F2 de la especie P. drechsleri solo infectaron foliolos de tomate (Cuadro 2; Figura 8), en los cuales se presentaron síntomas de necrosis, aproximadamente 48 h después de la inoculación. Las lesiones en foliolos de tomate fueron de hasta 45 mm después de 120 h, mientras que las hojas de chile no presentaron síntomas aparentes; esto puede deberse a que el híbrido utilizado para el bioensayo posiblemente presente tolerancia a los aislados utilizados. Erwin y Ribeiro (1996) mencionan que P. drechsleri se ha reportado como agente causal de pudriciones en frutos de tomate y chile. En México, P. drechsleri ha sido reportada infectando cártamo, chile ají, gerbera, lechuga, nochebuena y tomate (Mills et al., 1991; Romero-Cova y Solis-Aragon, 1996; Fernandez-Pavía et al., 2013).
Figura 8. Patogenicidad de P. drechsleri 1-2H2 en foliolos de tomate 48 h después de la inoculación. (A) Foliolo de tomate inoculado. (B) Foliolo de tomate testigo. (C) hoja de chile inoculada. (D) hoja de chile testigo.
Este primer estudio en México en los canales de riego del valle de Culiacán demuestra la presencia de P. hydropathica y P. drechsleri y resalta la importancia del agua de riego como medio de diseminación de ambos patógenos. Al mismo tiempo, sienta las bases para la realización de futuros estudios como conocer la dinámica poblacional a lo largo del ciclo agrícola; determinar si estas especies solo utilizan los canales de riego como medio de diseminación o completan su ciclo de vida en estos cuerpos de agua; así como determinar la presencia de P. hydropathica y P. drechsleri en infecciones naturales en plantas de importancia hortícola en la región. Este es el primer reporte de Phytophthora hydropathica en canales de riego en México. Estos resultados indican que es necesario continuar con investigaciones en ambientes naturales, ya sea en aguas superficiales o en suelos para conocer las diversas especies de Phytophthora presentes en México y de este modo considerar el riesgo potencial que estos microorganismos representan para la agricultura del país.
