El uso de plaguicidas en la agricultura, es una herramientas que permite alcanzar los objetivos de productividad y sustentabilidad si se combina con tecnologías adecuadas de manejo (^{Wheeler, 2002}). Esto es necesario porque la mayoría de los microorganismo fitopatógenos han generado resistencia a los ingredientes activos de los fungicidas químicos (^{Chávez-Solís et al., 2014}). Una alternativa eficiente y económica para el control de enfermedades es el uso de extractos de plantas que tengan propiedades fungicidas (^{Guerrero et al., 2007}). Los extractos vegetales y aceites esenciales, son biodegradables con un impacto negativo menor en el ambiente (^{Bravo et al., 2000}). Con base en lo anterior, se ha incrementado el interés por el uso de aceites esenciales de especias y otras plantas como antimicrobianos naturales en alimentos y cultivos agrícolas (^{Celis et al., 2012}). ^{Lambert et al. (2001)}, señalan que existe actualmente una demanda creciente por obtener en forma precisa los valores de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de diversos aceites esenciales, con la finalidad de obtener un balance entre la aceptación sensorial y la eficacia antimicrobiana, lo cual puede lograrse mediante estudios in vitro e in vivo.

En México, los fungicidas más usados contra M. fijiensis son: mancozeb y clorotalonil e ingredientes sistémicos de los grupos benzimidazoles, triazoles, estrobirulinas, y anilopirimidinas (^{Martínez-Bolaños et al., 2012}). El manejo químico de la sigatoka negra requiere de 10 a 45 aplicaciones de fungicidas por año, principalmente de mancozeb, propiconazol y tridemorf, con el consecuente riesgo de desarrollo de resistencia del patógeno a estos fungicidas (^{Mena-Espino y Couoh-Uicab, 2015}). El objetivo de este estudio fue evaluar la efectividad biológica de diferentes aceites esenciales extraídos de plantas nativas, sobre el crecimiento micelial de M. fijiensis en condiciones in vitro y la identificación de los principales compuestos químicos activos.

Los aceites esenciales se obtuvieron a partir de hojas de momo (Piper auritum), canela (Cinnamomum zeylanicum), orégano (Origanum vulgare), estafiate (Artemisia ludoviciana), mejorana (Origanum majorana), y frutos de pimienta (Pimenta dioica) y clavo (Syzygium aromaticum). Las muestras vegetales fueron colectadas en los Municipios de Teapa, Tabasco y Pichucalco, Chiapas, México. El material se secó bajo sombra y se trituró en molino manual. El polvo resultante se sometió a un proceso de hidrodestilación por dos horas en una proporción de 30 g en 500 ml de agua (^{Domínguez, 1979}) y el aceite fue capturado mediante uso de un aparato tipo Clevenger (^{Muñoz et al., 2001}). El aceite se conservó en frascos color ámbar bajo refrigeración.

Mycosphaerella fijiensis fue aislado directamente de tejido infectado a partir de plantas enfermas de banano colectadas en las zonas productoras del Municipio de Teapa, Tabasco. Se cortaron trozos de tejido vegetal enfermo de aproximadamente 1 cm² y se pegaron a discos de papel filtro. El material enfermo se desinfectó superficialmente en una solución de hipoclorito al 3% y posteriormente se lavó por triplicado con agua destilada. Los discos se colocaron en la tapa de placas Petri con medio de cultivo sólido (Agar-Agua). A los tres días de crecimiento del hongo, éste se transfirió a medio de cultivo PDA para su desarrollo (^{Stover, 1963}).

Se prepararon las diferentes concentraciones de cada aceite vegetal: 50, 100, 500, 1000 y 5000 ppm, en tubos de ensaye con 10 mL de agua destilada estéril. El contenido de cada tubo se mezcló en matraces con medio PDA (30 mL) y a continuación el contenido de cada matraz se distribuyó en cuatro placas Petri (10 mL). Como testigo se utilizaron placas PDA sin tratamiento. Los aceites esenciales extraídos de siete especies vegetales fueron evaluados en las cinco concentraciones, excepto S. aromaticum, el cual no fue evaluado a la concentración de 50 ppm. Para la inoculación, a partir del medio de cultivo con la cepa de M. fijiensis, se cortaron pequeños discos de 0.4 mm² aproximadamente y se colocaron al centro de cada placa Petri.

Se usó un diseño experimental completamente al azar con cuatro repeticiones, donde los tratamientos fueron las cinco concentraciones de cada aceite vegetal, más un testigo absoluto (PDA).

Las variables medidas fueron el porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR) y el propio crecimiento de M. fijiensis. Para evaluar la eficacia de los tratamientos, se midió el desarrollo de la colonia fúngica (mm) hasta que las cajas Petri del testigo estuvieron completamente cubiertas con micelio. El PICR se calculó con la fórmula:

donde RC= radio del micelio en el testigo y RT= radio del micelio en los tratamientos.

Los datos fueron analizados con el programa SAS, versión 9.0. Se realizó un análisis de varianza y prueba de rango múltiple de medias Tukey, para identificar el efecto de tratamiento.

Después de determinar la actividad antifúngica de los aceites vegetales, se eligieron aquéllos que mostraron la mayor actividad biológica, para conocer su composición química aproximada, aplicando las técnicas cromatografía en capa fina (CCF) (^{Randerath, 1970}) y cromatografía en columna (CC) (^{Abbot y Andews, 1970}). Previo a la cromatografía, se revisó la literatura para tener referencia del tipo de metabolitos presentes en los extractos crudos obtenidos y su actividad biológica, con lo cual se efectuó la relación correspondiente con los resultados de fitoquímicos identificados en este estudio.

De acuerdo al porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR) y el crecimiento del micelio de M. fijensis, los aceites de mejor efecto inhibitorio sobre el desarrollo de Mycosphaerella fijiensis, fueron los extraídos de C. zeylanicum, O. vulgare y P. dioica, con efecto inhibitorio a partir de la dosis de 100 ppm, con valores de 90.5, 71.5 y 58%, de inhibición, respectivamente; a una concentración de 500 ppm, la inhibición fue del 100 %. Los otros aceites registraron valores menores: S. aromaticum 10.5%, P. auritum 22.5%, A. ludoviciana 38% y O. majorana 45.9%. Los aceites de A. ludoviciana y O. majorana, mostraron efecto inhibitorio significativo a una concentración de 1000 y 5000 ppm. S. aromaticum no mostró ningún efecto inhibitorio sobre el hongo (Cuadro 1).

El primer día de exposición, los aceites de C. zeylanicum, O. vulgare y P. dioica a una dosis de 100 ppm, registraron un 100% PICR, con nulo crecimiento de M. fijiensis y este mismo efecto se prolongó hasta los tres días con el aceite esencial de C. zeylanicum. A los cinco días de exposición, estos mismos aceites registraron un mínimo desarrollo micelial de M. fijiensis con valores de 2 a 9 mm (Figura 1A); mientras que, con la concentración de 500 ppm en los tres aceites, la inhibición del crecimiento del hongo fue del 100% (Figura 1B).

Figura 1 Crecimiento del hongo Mycosphaerella fijiensis (mm) en los aceites esenciales obtenidos a partir de diferentes especies de plantas. a) 100 ppm y b) 500 ppm. DDI= días después de la inoculación. 

La capacidad antifúngica del aceite esencial de C. zeylanicum coincide parcialmente con lo reportado por ^{Barrera y García (2008)}, quienes encontraron que este aceite tuvo un efecto inhibitorio del 70% en el crecimiento de Fusarium spp aislado de papaya a una concentración de 150 µg mL^-1. Con respecto al aceite de O. vulgare, ^{Soylu et al. (2006)} encontraron inhibición completa del crecimiento de Phytophthora infestans a partir de 0.3 y 6.4 ug ml^-1. ^{Cáceres et al. (2013)} reportaron que el extracto de O. vulgare a una concentración de 200 ppm, causó inhibición total de Fusarium oxysporum y Aspergillus niger; en tanto que para Alternaria alternata, Geotrichum candidum, Trichoderma spp. y Penicillum digitatum la inhibición fue a partir de 0.25 ᶙL mL^-1. ^{Ramírez et al. (2011)} reportaron que el mismo aceite obtenido como hidrolato por destilación al 50% (volumen-volumen) inhibió completamente el desarrollo de Moniliophthora roreri en medio de cultivo. También ^{Ramírez et al. (2016)}, concluyen que los hidrodestilados y aceites de C. zeylanicum, S. aromaticum y P. dioica obtenidos por microondas, son eficientes en inhibir el desarrollo de A. solani y C. gloesporioides.

El aceite de O. majorana mostró efecto inhibitorio del 95% a la concentración de 1000 ppm. El efecto fungistático de esta especie fue reportado por ^{Gamboa et al. (2003)}, quienes encontraron que el extracto metanólico de mejorana inhibió el 100% del crecimiento micelial de P. infestans a partir de 8000 ppm y 59 a 80% de inhibición de Rhizoctonia solani a 2000 y 4000 ppm, respectivamente. ^{Damian et al. (2010)}, observaron que el principio activo del extracto de A. ludoviciana fue el diclometanol-metanol (1:2 v/v), el cual inhibió el 100% del crecimiento micelial de Phytophthora cactorum, P. capsici, P. cinnamomi y P. mirabilis, así como un 60% de P. infestans, a una concentración de 100 ppm. En estudio, el aceite de A. ludoviciana inhibió el 100% del desarrollo micelial de M. fijiensis a una concentración de 1000 ppm.

Los componentes químicos principales activos identificados fueron el aldehído cinámico y el eugenol en los aceites esenciales de C. zeylanicum (50 y 10%, respectivamente), P. dioica y O. vulgare. El eugenol, es el de mayor concentración en P. dioica y O. vulgare, con 72.6 y 76.3%, respectivamente, seguido del cariofileno y limoneno. El resto de los compuestos se reportaron en concentraciones menores, de los cuales el safrol solo se presenta en el aceite de C. zeylanicum, mientras que el mirceno y el Ocimeno solo están en el aceite de P. dioica; el limoneno y el carvacrol, solo están presentes en el aceite de O. vulgare (Cuadro 2).

^{Barrera y García (2008)}, reportaron que el aldehído cinámico y el carvacrol inhibieron completamente el crecimiento del micelio del hongo Fusarium spp. a partir de 100 µg mL^-1. ^{Wang et al. (2010)} reportaron que Fusarium moniliforme, Sclerotinia sclerotiorum, Cercospora beticola, Mycogone perniciosa, Macrophoma kawatsukai, Thanatephorus cucumeris, Alternaria alternata y Botrytis cinerea, fueron altamente sensibles a la aplicación de eugenol, de los cuales B. cinerea y S. sclerotiorum fueron los más sensibles a este principio activo, con valores de CE₅₀ de 38.6 y 39.9 ᶙg mL^-1, respectivamente.

^{Gill y Holley (2006)} evaluaron el eugenol, carvacrol y cinamaldehido sobre los cambios de ATP y viabilidad celular de Escherichia coli, Listeria monocytogenes y Lactobacillus sakei. Los resultados indican que el mecanismo de acción del eugenol y carvacrol es la disrupción de la actividad citoplasmática de la membrana, lo que aumenta su permeabilidad no específica. La ausencia de un aumento en el ATP extracelular de células tratadas con cinamaldehído, sugiere que eugenol y carvacrol poseen actividad inhibidora de la ATPasa que carece de cinamaldehído. Ante estas evidencias, se relaciona que el efecto de los aceites de C. zeylanicum, P. dioica y O. vulgare, inhibieron el crecimiento del micelio de M. fijiensis, por la presencia de eugenol y aldehído cinámico; así como el carvacrol en el aceite de O. vulgare.