De acuerdo a ^{Dombrovsky y Smith (2017}) el comercio mundial de semillas ha contribuido a la transmisión y diseminación de brotes de nuevas enfermedades en diferentes países, particularmente de virus pertenecientes al género Tobamovirus, entre ellos el ToBRFV. Los cultivos de tabaco, jitomate y chile (familia Solanaceae) son afectados severamente por virus del género Tobamovirus: Tobacco mosaic virus (TMV), Tobacco mild green mosaic virus (TMGMV), Tomato mosaic virus (ToMV) y Pepper mild mottle virus (PMMoV) (Dombrovsky y Smith, 2017).

Las especies del género Tobamovirus son partículas de varilla rígida, poseen un genoma de ARN monocatenario de sentido positivo de ~6.4 kb con cuatro marcos de lectura abierto (ORFs por sus siglas en inglés de Open reading frames). El ORF1 y ORF2 están separados por un codón de paro y codifican dos proteínas relacionadas con la replicación del virus con un peso de 126 y 183 kDa, respectivamente. El ORF3 codifica la proteína de movimiento de 30 kDa, mientras que el ORF4 codifica para la cápside de 17.5 kDa (^{Luria et al., 2017}).

Los tobamovirus se transmiten fácilmente de forma mecánica y semilla (partículas infecciosas en la testa) que al germinar infectan las plántulas. El virus puede permanecer en residuos vegetales y suelos contaminados con virus durante varios meses y en semillas infectadas durante varios años (^{Dombrovsky y Smith, 2017}).

Recientemente en Israel (^{Luria et al., 2017}) y Jordania (^{Salem et al., 2015}) se reportó un nuevo tobamovirus denominado Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV) infectando jitomate, el cual ocasiona una reducción en la cantidad de flores y frutos, necrosis en el pedúnculo del fruto y hojas del cáliz. En los frutos de plantas enfermas se observan áreas de color amarillo o marrón y rugosidades en su superficie (^{Salem et al., 2015}).

En 2018, productores de jitomate y chile de la región de Yurécuaro y Tanhuato, Michoacán, han reportado síntomas en frutos con coloración amarilla, manchas verdes y deformación, estriado verde y manchas irregulares color marrón (Fig. 1a) y en hojas síntomas de mosaico, moteado y amarillamiento. Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue determinar si el ToBRFV se encuentra presente en Yurécuaro y Tanhuato, Michoacán, afectando los cultivos de jitomate y chile.

La presente investigación se llevó a cabo en las instalaciones del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria. En septiembre de 2018, en los municipios de Yurécuaro y Tanhuato, Michoacán, se colectó tejido foliar, flores y frutos de plantas de jitomate y chile con síntomas de la enfermedad: frutos con coloraciones amarillas, manchas y estriados verdes, manchas irregulares de color marrón y deformación, mientras que en el follaje, moteados cloróticos y mosaicos. En flores no se observaron síntomas de acuerdo a lo reportado por otros autores. En Yurécuaro se tomaron dos muestras simples dirigidas de plantas de jitomate de diferentes unidades de producción y en Tanhuato seis muestras (cinco de jitomate y una de chile). Las muestras fueron debidamente identificadas y trasladadas al laboratorio donde fueron resguardadas a 4 ˚C hasta su análisis.

De cada muestra, se separó la nervadura central de las hojas y se les realizó un corte trasversal para dividir la muestra en dos partes: la primera se utilizó para la preparación de rejillas y observarlas al microscopio electrónico de transmisión, y la segunda para la extracción de RNA total.

Se maceró 0.1 g de nervadura central de hojas infectadas en 500 µL de agua bidestilada con un pistilo de plástico estéril; el macerado fue centrifugado a 9000 g durante tres minutos para eliminar restos de tejido vegetal. Sobre rejillas de cobre de 300 mallas (Electron Microscopy Sciences®) recubiertas con una membrana de formvar/carbon® se colocaron 10 µL de sobrenadante y 10 µL de ácido fosfotúngstico al 1 % (Fluka analytical), se mezclaron por pipeteo y se dejaron durante 30 segundos, al término de los cuales se eliminó el exceso con un pedazo de papel filtro. Las rejillas se observaron por microscopia electrónica de transmisión y las imágenes fueron fotografiadas.

El RNA total se extrajo a partir de 100 mg de nervaduras centrales con el Kit SV Total RNA Isolation System Start-Up^® (Promega™), de acuerdo a las indicaciones del fabricante. La pureza y concentración del RNA extraído se cuantificó por espectrofotometría (Nano Drop 2000^®, Thermo Scientific™).

La retrotranscripción se realizó con iniciadores aleatorios (Random Hexamer, Invitrogen™), siguiendo las indicaciones del fabricante con las siguientes condiciones de amplificación: 1 ciclo a 42 ˚C por 30 min, 1 ciclo a 99 ˚C por 5 min y finalmente a 12 ˚C durante 5 min. En la PCR se usaron los iniciadores F-3666 (5´-ATGGTACGAACGGCGGCAG-3´) y R-4718 (5´-CAATCCTTGATGTGTTTAGCAC-3´) que amplifican un fragmento de 1052 pb del ORF2 (^{Luria et al., 2017}). La mezcla de reacción consistió en 12.5 µL de Platinum™ SuperFi™ PCR Master Mix (2X) (Invitrogen), 5 µL de Super FiTM GC Enhancer (5X) (Invitrogen), 3 µL de agua grado biología molecular (Invitrogen), 1.25 µL del primer F-3666 (10 µM), 1.25 µL del primer R-4718 (10 µM) y 2 µL del templado de cDNA, en un volumen final de 25 µL. La amplificación se llevó bajo las siguientes condiciones: 1 ciclo de 98 ˚C por 5 min, 25 ciclos a 98 ˚C por 1 min, 62 ˚C por 3 min y 72 ˚C por 3 min con una extensión final a 72 ˚C por 10 min. Los productos amplificados fueron visualizados en un gel de agarosa al 1.5 %.

Los productos de la RT-PCR fueron secuenciados en el Laboratorio de Biología Molecular del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria, utilizando el equipo Applied Biosystems modelo 3130; las secuencias obtenidas fueron ensambladas y editadas para obtener tamaños de 900 pb y comparadas en la base de datos del GenBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome). El alineamiento local se realizó utilizando el programa MEGA v7.0.26 y el algoritmo MUSCLE. Se construyó una matriz con secuencias de Tobacco mosaic virus (TMV), Tomato mosaic virus (ToMV) y Tomato mottle mosaic virus (ToMMV) para realizar un análisis filogenético. Se usaron como grupo externo dos secuencias correspondientes a Pepper mild mottle virus (PMMoV) (NC_003630.1) y Tobacco mild green mosaic virus (TMGMV) (AB078435.1). Se usó el método Maximum Likelihood (ML) basado en el modelo de Tamura-Nei, con 1000 iteraciones de bootstrap. Los árboles iniciales para la búsqueda heurística se obtuvieron automáticamente aplicando los algoritmos Neighbor-Join y BioNJ a una matriz de distancias por pares estimadas utilizando el enfoque Maximum Composite Likelihood (MCL) y seleccionando la topología con un valor de verosimilitud log superior con el programa MEGA v7.0.26.

Los síntomas en frutos y plantas de jitomate colectadas en Yurécuaro y Tanhuato fueron similares a los reportados por ^{Luria et al. (2017}) y ^{Salem et al. (2015}) (Figura 1a). Las muestras analizadas amplificaron el producto esperado de 1052 pb. Las secuencias obtenidas de las muestras M1 (MK273183), M2 (MK273184), M5 (MK273187) y M7 (MK273189) tuvieron 100 % de identidad con las secuencias de las muestras identificadas en Israel (KX619418.1) y Jordania (KT383474.1), mientras que las muestras M3 (MK273185), M4 (MK273186), M6 (MK273188) y M8 (MK273190) mostraron 99 % de identidad con las secuencias de Israel y Jordania. (Figura 1b).

En el árbol filogenético con la mayor probabilidad de registro (-2680.43) se observa que las secuencias de las muestras M1-M8 se agruparon dentro del nodo que tiene las secuencias de Israel (KX619418.1) y Jordania (KT383474.1) (Figura 1c). Todos los grupos correspondientes a las otras especies de Tobamovirus tienen porcentajes de inferencia del 90 - 100 % a partir de 1000 iteraciones bootstrap. En las rejillas preparadas con extractos de hojas de jitomate se observaron partículas virales en forma de varilla rígida de aproximadamente 300 nm de longitud similares a las reportadas por ^{Luria et al. (2017}) (Figura 1d).

Estos resultados indican la presencia de Tomato brown rugose fruit virus asociadas a plantas de jitomate y chile colectadas en Yurécurao y Tanhuato y sugieren que proceden de semilla comercial producida en Israel y Jordania. El ToBRFV solo ha sido reportado en Asia y Medio Oriente y se tienen reportes sobre su fácil diseminación mecánica y por semillas (^{Dombrovsky y Smith, 2017}). Con base a los resultados obtenidos, se considera necesario que en el futuro se realicen las pruebas de patogenicidad correspondientes.

Figura 1 Síntomas observados en frutos de jitomate positivos al ToBRFV. Frutos con coloraciones amarillas (a), manchas verde y deformación (b), estriado verde (c) y frutos con manchas marrón (d). Productos de 1052 pb obtenidos por RT-PCR utilizando los oligonucleótidos para el género Tobamovirus (e). Árbol de máxima probabilidad de las se cuencias del fragmento ORF2 de muestras ToBRFV con otros Tobamovirus (TMV, ToMMV y ToMV) (f). Partícula viral en forma de varilla rígida presente en muestras de jitomate característico de Tobamovirus (g).