Las enzimas pertenecen a una gran diversidad de moléculas de origen natural y, como parte de sus atributos, algunas poseen actividad antimicrobiana (^{Oh y Park, 2018}). Las enzimas presentan características particulares que las convierten en excelentes catalizadores biológicos y aceleran la velocidad a la que se llevan a cabo las reacciones biológicas específicas para formar o degradar un nuevo producto (^{Sheng et al., 2016}). En los microorganismos, como en otros tipos de organismos vivos, las enzimas tienen un papel primordial en sus funciones biológicas, como la división y el desarrollo celular, la defensa y la adaptación a condiciones desfavorables en un ambiente dado (^{Gow et al., 2017}). Por otro lado, la capacidad que tienen los organismos de colonizar hábitats específicos ha dado como resultado el surgimiento de varios problemas económicos y sanitarios en todo el mundo (^{Gálvez-Iriqui et al., 2019}). Sin embargo, las plantas y los organismos no están indefensos ante el ataque microbiano, ya que las enzimas tienen una amplia participación en los procesos de defensa.

Hasta ahora, las enzimas antimicrobianas que han sido estudiadas son, entre otras, las proteolíticas, las oxidativas y las que tienen la capacidad de hidrolizar polisacáridos, incluidas las amilasas, las liasas, Dispersin B y las lisozimas (^{Thallinger et al., 2013}). En particular, se ha reportado ampliamente la actividad de las lisozimas contra varios microorganismos debido a su capacidad de hidrolizar los polímeros presentes en la pared celular de las bacterias, específicamente aquellas que pertenecen al grupo Gram (+) (^{Phillips, 1967}). En estudios recientes se ha reportado también la capacidad que tiene esta enzima de hidrolizar la pared celular de hongos y levaduras (^{Manikandan et al., 2015}; ^{Zhou et al., 2017}; ^{Hernández-Téllez et al., 2018}). Asimismo se ha reportado su efectividad como agente antibacterial y antifúngico cuando se combina con otros compuestos activos (Hernández-Téllez et al., 2018; ^{Wu et al., 2018a}). Las moléculas biopoliméricas como el quitosano se han utilizado en la preparación de materiales funcionales o de compuestos formulados a base de lisozimas. El quitosano es un biopolímero policatiónico capaz de retardar o inhibir el desarrollo de bacterias y hongos al interactuar con los componentes celulares presentes en la membrana y la pared celular (^{Bautista-Baños et al., 2016}).

La combinación de lisozimas y quitosano se ha utilizado en la fabricación de materiales en forma de soluciones, películas, fibras, hidrogeles y micro- y nanopartículas, cuyo uso se ha propuesto para el control de microorganismos en los ámbitos de la salud humana, la agricultura y la industria de transformación y preservación de alimentos (^{Wu et al., 2018a}). Por tanto, es posible suponer que las lisozimas, solas o combinadas con el quitosano, pueden actuar en los diferentes biopolímeros y péptidos presentes en las células de los hongos y la levadura induciendo la muerte de la célula o anormalidades durante el crecimiento. Por tanto, el objetivo de la siguiente revisión es presentar los aspectos y las características más importantes de las lisozimas y sus aplicaciones tecnológicas como enzimas antimicrobianas.

Información general sobre la lisozima. La lisozima o muramidasa forma parte del grupo de las hidrolasas glucosídicas y cataliza la hidrólisis del enlace β (1-4) entre la N-acetilglucosamina y el ácido N-acetilmurámico de las paredes celulares de las bacterias (^{Jana et al., 2017}). Su estructura primaria está formada por una cadena polipeptídica simple cuyo número de residuos de aminoácidos varía: 130 en la lisozima humana (hLyz) y 129 en la lisozima de pollo (cLyz) (^{Cao et al., 2015}). Sin embargo, ambas tienen una estructura muy similar. La cLyz es una enzima con 14.6 kDa y un alto punto isoeléctrico de 11.16 (^{Yu et al., 2018}), en tanto que la hLyz tiene 14.7 kDa y un punto isoeléctrico de 9.28; sin embargo, el aspartato-52 y el glutamato-35 son los aminoácidos esenciales en la actividad enzimática (Cao et al., 2015). Además, la estructura terciaria de la enzima de ambas lisozimas es similar, pero difiere en una región beta. En la Figura 1 se muestran los cuatro hélices alfa, las cuatro bobinas aleatorias y una doble hoja beta plegada y antiparalela de la lisozima humana y una hoja beta plegada trenzada y antiparalela de la lisozima de pollo (^{Strader, 2018}). En general, la lisozima se pliega en una estructura terciaria compacta y globular con una larga hendidura en su superficie (^{Sheng et al., 2016}; Jana et al., 2017; Strader, 2018). La estructura de la enzima tiene seis triptófanos (Trp-28, Trp-62, Trp-63, Trp-108, Trp-111 y Trp-123) y tres tirosinas (Tyr-20, Tyr-23 y Tyr-53), de los cuales tres residuos de Trp se localizan en el sitio de unión del sustrato, dos en la parte hidrofóbica y uno en el borde de la lisozima. Dentro de estos aminoácidos, Trp-62 y Trp-108 se encuentran en el sitio de unión del sustrato y desempeñan una función esencial en la unión del sustrato y la estabilización de la estructura de la enzima (Figura 2) (Sheng et al., 2016; ^{Wu et al., 2019}).

Figura 1 Estructura terciaria de la lisozima humana (rojo) y de la lisozima de clara de huevo (pollo, azul) (Strader, 2018). 

Sustrato de la lisozima. El peptidoglucano es un componente básico de la pared celular de las procariotas fuera de la membrana citoplásmica (^{Jana et al., 2017}; ^{Monteiro et al., 2018}). Esta estructura polimérica es fundamental para las células de las bacterias, ya que lleva a cabo el mantenimiento de su morfología, sirve como andamio para fijar otros componentes en la envoltura celular, como las proteínas, se ocupa del estrés mecánico y permite que los nutrientes lleguen a la membrana plásmica que contiene los transportadores (e.d., proteínas, porinas, permeasas, entre otros) necesarios para su translocación en el citosol, procesos todos estos necesarios para la supervivencia de las bacterias (Jana et al., 2017).

Figura 2. Estructuras primaria (a) y terciaria (b) de la lisozima de pollo. Sitio activo con los aminoácidos responsables de la actividad de la lisozima (c). (Held y Van Smaalen, 2014; Hardin et al., 2016). 

El peptidoglucano o mureína es un biopolímero formado por cadenas lineales de glucanos, entrecruzadas por péptidos cortos con diferentes composiciones, dependiendo del tipo de bacteria. Están ensambladas por residuos de N-acetilglucosamina (GlcNAc) y el N-acetil ácido murámico (MurNAc) unidos por enlaces β (1-4) (^{Jana et al., 2017}; ^{Monteiro et al., 2018}). Las bacterias patogénicas han generado resistencia a la actividad bacteriolítica del hospedante que secreta la lisozima durante la infección; el mecanismo primario es la modificación de la cadena de su peptidoglucano glucano (^{Sukhithasri et al., 2013}) (Figura 3).

Figura 3. Estructura de un peptidoglucano sensible y uno resistente a la lisozima (a) y escisión enzimática de lisozima; (b) Bacteria patogénica que modifica esta estructura por O-acetilación de AAM en la posición C-6, N-deacetilación de NAG en la posición C-2 y N-glicosilación de ácido murámico en la posición C-2 (Sukhithasri et al., 2013; Taylor et al., 2019). 

Recientemente, se ha reportado la síntesis de los monosacáridos y disacáridos del ácido acetilmurámico (AAM), así como la posibilidad de que estos compuestos puedan unirse al sitio activo de la lisozima, para producir su hidrólisis (^{Jana et al., 2017}). La disposición en el espacio de los grupos funcionales de estos compuestos pueden impedir o promover la unión al sitio activo de la enzima, en este caso, los grupos metoxilo (-OCH₃), acetilo (-COCH₃) y metilo (-CH₃). Este estudio sugiere que los sustratos relacionados con el peptidoglucano, que puedan adoptar la conformación necesaria para interactuar con el sitio activo, serán hidrolizados en los enlaces o-glicosídicos por la lisozima.

De aquí surge la pregunta sobre cómo pueden interactuar la lisozima y otros polisacáridos distintos al peptidoglucano, sobre todo aquellos que están presentes en la pared celular de los hongos o la levadura, como la quitina y el quitosano, que están estructuralmente relacionados, o incluso otros polisacáridos como los β-glucanos. Sin embargo, es de destacar que estos microorganismos no tienen peptidoglucano. Es importante señalar que aún no se ha reportado la manera en que estos polisacáridos interactúan a nivel molecular (^{Sowa-Jasiłek et al., 2016}; ^{Zhou et al., 2017}; ^{Hernández-Téllez et al., 2018};). Es posible que la quitina (un polímero de cadena larga de N-acetilglucosamina) o el quitosano (compuesto de residuos de D-glucosamina y N-acetil-D-glucosamina unidos a β-(1→4)) tengan una función importante en la interacción entre la lisozima y la pared celular fúngica (^{Han et al., 2012}).

Mecanismo de catálisis. El mecanismo catalítico de la lisozima fue el primero que se estudió del grupo de las glicosidasas. Éste cataliza la escisión de los enlaces β-1,4-glicosídicos entre el ácido N-acetilmurámico y la N-acetil glucosamina en el peptidoglucano (^{Yu et al., 2018}). La lisozima tiene dos residuos de ácido carboxílico, aspartato-52 y glutamato-35, que se encuentran estratégicamente situados en el enlace glicosídico y catalizan la escisión en dos pasos (Figuras 3, 4 y 5).

Figura 4. Complejo enzima-sustrato de la lisozima de pollo donde se pueden apreciar los residuos catalíticos Glu-35 y Asp-52 en el sitio activo. Figura editada de Hardin et al., 2016. 

En general, el proceso catalítico comienza con un fragmento de seis residuos del polisacárido (subsitios A-F); este fragmento se une al sitio activo de la enzima, donde todos los monómeros del fragmento son fácilmente incrustados, excepto uno (D). El monómero D produce una conformación de media silla, la cual cambia para entrar en un punto específico del sitio activo de la enzima. Este sitio contiene dos aminoácidos iónicos, ácidos glutámico (Glu-35) y aspartato (Asp-52). Estos dos residuos desempeñan funciones muy diferentes; el Glu-35 actúa como residuo ácido-base y el Asp-52 como un nucleófilo enzimático (^{Jana et al., 2017}).

En su trabajo, ^{Phillips (1967}) estableció la distancia entre los residuos glicosídicos D y E que unen el oxígeno. El oxígeno más cercano de Glu 35 es de casi 3 Å; el más cercano de Asp 52 es de aproximadamente 3 Å desde el átomo C(1) del residuo D de azúcar, y de aproximadamente la misma distancia desde el átomo de oxígeno del anillo de ese residuo.

En el primer paso (glicosilación), D se tensa en una conformación similar a la del estado de transición. El residuo ácido-base Glu-35 actúa como donador de un protón al oxígeno, que participa en la unión glicosídica de los residuos D y E; por tanto, la reducción del oxígeno induce la escisión del enlace C-O. Glu-35 tiene ahora un oxígeno de carga negativa y D es un ión inestable con carga positiva. Al mismo tiempo, el carboxilato desprotonado de Asp-52 realiza un ataque nucleofílico al carbón anomérico y, mediante resonancia, estabiliza el carbón con carga positiva. En el segundo paso (deglicosilación), el Glu-35 desprotonado actúa como base general donde acepta un protón (desprotonado). Este protón proviene de una molécula de agua directamente posicionada y lleva a cabo una sustitución nucleofílica en la enzima glicosil. El hidróxido resultante se puede unir con el residuo D neutralizando la carga y permitiendo su liberación de la hendidura. A continuación, el nucleófilo se regenera en el sitio activo (Figura 5) (^{Stick et al., 2009}; ^{Jana et al., 2017}; ^{Strader, 2018}; ^{Wu et al., 2019}).

Diferencias catalíticas entre los tipos de lisozimas. La lisozima y las enzimas tipo lisozima (poca actividad de la muramidasa) han sido aisladas y purificadas a partir de fuentes y organismos naturales. Estas enzimas pueden inducir cambios en la estructura de la célula y causar la muerte de los microorganismos (^{Chen et al., 2016}). En los animales, existen cuatro principales tipos de lisozimas, que se clasifican dependiendo de la fuente: tipo-c (de pollo o convencional), type-g (ganso), tipo-i (invertebrado) y tipo-ch (chalaropsis) (^{Zhou et al., 2017}). Los tipos -c y -g se encuentran en todos los vertebrados, en tanto que los invertebrados típicamente producen el tipo-i. Los diferentes tipos de lisozima se han reportado en algunos invertebrados, por ejemplo, lisozimas tipo c en artrópodos, de tipo g en moluscos y de tipo-ch en nematodos (Zhou et al., 2017; ^{Yu et al., 2019}).

Figure 5 Mecanismo catalítico de la lisozima mediado por los aminoácidos Glu-35 y Asp-52 (Stick et al., 2009). 

En el Cuadro 1 se resumen los diversos tipos de lisozimas y enzimas tipo lisozimas de animales, plantas y los que se obtienen por recombinación genética. Tanto en los vertebrados como en los invertebrados, las lisozimas y las enzimas tipo lisozimas son enzimas multifuncionales que sirven como moléculas de inmunidad innata inespecífica responsables de la defensa antibacterial (patógenos y no patógenos) y/o de la digestión (^{Zhou et al., 2017}; ^{Wu et al., 2019}). No obstante, pocos estudios han reportado estimulación previa con una infección bacteriana o fúngica en los organismos hospedantes para inducir la expresión de las lisozimas y las enzimas tipo lisozimas (Zhou et al., 2017; ^{Yu et al., 2019}); después de que fueron aislados, la actividad de la lisozima en algunos de ellos fue poca o nula, pero la actividad de la peptidasa aumentó o fue sobreexpresada en el tracto digestivo. Este comportamiento sugiere que ciertas lisozimas de organismos vivos o enzimas tipo lisozimas tienen una función primaria relacionada con las funciones digestivas y la nutrición (Zhou et al., 2017; Yu et al., 2019).

Las diferencias catalíticas entre los diversos tipos de lisozima sugieren que la ausencia de actividad de la muramidasa de las lisozimas tipo-i con respecto a las de tipo-c podrían deberse a diferencias en la secuencia del aminoácido. ^{Zhou et al. (2017}) obtuvieron y purificaron una lisozima recombinante de tipo-i de cangrejo de manglar (Scylla paramamosain), que tenía 54% de similitud con la lisozima tipo-i aislada de camarón (Litopenaeus vannamei); ésta fue altamente expresada tanto en el tracto digestivo como en los hemocitos. El análisis de la secuencia del aminoácido reveló que esta enzima carecía de los dos aminoácidos responsables de la actividad de la muramidasa, los ácidos aspártico y glutámico. Pese a esto, los homólogos tipo-i de la lisozima en invertebrados, la enzima Splys-i, mostraron actividad antimicrobiana contra bacterias tanto Gram (+) como Gram (-), así como en células fúngicas, cuando los cangrejos fueron previamente expuestos a éstas. Los autores sugieren que el mecanismo de acción contra estos microorganismos no está relacionada con la actividad de la muramidasa sino con la actividad de la isopeptidasa y los fenómenos de aglutinación de las proteínas en la superficie microbiana, haciendo posible la unión con los componentes de la célula como los peptidoglucanos y los lipopolisacáridos.

La lisozima tipo-i obtenida de lombriz de tierra Eisenia andrei mostró una secuencia del polipéptido de 226 residuos de aminoácidos, con 14 residuos de cisteína (Cys). La teoría de los autores es que posiblemente los residuos de Cys tienen que ver con el alto número de puentes de azufre que distinguen el tipo-i de otras lisozimas (^{Yu et al., 2019}). Un aspecto importante de esta secuencia enzimática (Ea-iLys) es que contiene tres residuos de ácidos aspártico y glutámico, y serina, que promueven la actividad de la muramidasa, la alanina y la isopeptidasa mediada por la histidina. Los 14 residuos de Cys forman siete puentes de disulfuro, que bloquean los pocos sitios de escisión de la tripsina (< 10), posiblemente haciendo que esta enzima sea resistente a las proteinasas digestivas que secretan las glándulas intestinales. Estas diferencias sugieren que la actividad de esta enzima se concentra principalmente en las funciones digestivas y que no es parte de los efectores del sistema inmunológico (Yu et al., 2019). Por último, ^{Wang et al. (2018}) obtuvieron tres lisozimas recombinantes de tres genes de mosquita blanca (Bemisia tabaci), una de tipo-c (Btlysc) y dos de tipo-i (Btlysi1 y Btlysi2). Estas enzimas mostraron variaciones en el número de aminoácidos en sus secuencias, 146 en las de tipo-c y 156 y 160 en las dos de tipo-i, respectivamente. Las de tipo-c contenían ocho residuos de cisteína consevados, en tanto que Btlysi1 y Btlysi2 tenían 12 residuos de cisteína conservados con la capacidad de formar seis puentes de disulfuro.

Estos resultados coinciden con los que obtuvieron ^{Yu et al. (2019}) y ^{Zhou et al. (2017}). Estos autores sugieren que las lisozimas de tipo-i contienen numerosos puentes de disulfuro debido a su relación con la función digestiva de E. andrei y S. paramamosain. Además, la expresión de la lisozima de tipo-c ocurrió antes y después de que la mosquita blanca fuera infectada con el hongo entomopatógeno Beauveria bassiana, sin cambiar su patrón de comportamiento; esto sugiere que la lisozima tipo-c desempeña la función de un efector del sistema inmunológico. Las dos enzimas de tipo-i cambiaron su patrón de expresión cuando la alimentación de las mosquitas varió y no contrajeron ningún tipo de infección con microorganismos patogénicos, lo cual indica que estas enzimas están muy relacionadas con los procesos digestivos.

Efecto del pH y la temperatura en la actividad enzimática. Los aminoácidos responsables de la escisión del polisacárido son susceptibles a variaciones en la acidez del medio. El pH y la temperatura afectan la actividad catalítica de la enzima y, en consecuencia, la velocidad de la reacción, que lleva a cabo el mecanismo de acción. Dependiendo de la fuente de aislamiento y purificación, la lisozima puede tener pequeñas variaciones en su pH y temperatura óptimos (Cuadro 1). La mayoría de los estudios indican que las escalas óptimas de pH van desde ligeramente ácido (5.5-6.7) para el tipo-c (^{Fiołka et al., 2005}; ^{Kim et al., 2012}; ^{Chen et al., 2016}; ^{Wang et al., 2018}) hasta alcalino (7.4-8) para el tipo-i (^{Manikandan et al., 2015}; ^{Zhou et al., 2017}; ^{Yu et al., 2019};). La temperatura óptima de las lisozimas varía según la fuente, pero la mayoría de los estudios indican que es de aproximadamente 40 °C para insectos y animales.

Actividad antibacterial y antifúngica de la lisozima. La actividad biológica de la lisozima causa una interferencia en el crecimiento bacterial, sobre todo en las Gram (+). Además, el descubrimiento de la estructura de la lisozima promovió más estudios de investigación sobre su posible aplicación. En general, la actividad de la lisozima se determina utilizando cepas de Micrococcus sp., que sirven como sustrato para visualizar la actividad por medio de turbidimetría. Actualmente, el ensayo de Micrococcus sp. es considerado el estándar de referencia para medir la actividad de la lisozima (^{Fiołka et al., 2005}; ^{Kim et al., 2012}).

^{Fiołka et al. (2005}) aislaron y purificaron una lisozima de la pupa de Cameraria ohridella capaz de lisar las células de Bacillus megaterium, ocasionando una disminución en la densidad óptica del crecimiento bacterial comparada con la del control de la lisozima. Según los autores, es posible que las lisozimas tengan dos funciones, una forma digestiva que descompone las bacterias ingeridas en el intestino y una respuesta de defensa contra patógenos que se introducen en el hemocele. ^{Wang et al. (2005}) obtuvieron resultados similares con una lisozima purificada de frijoles mungo (Phaseolus mungo), que mostraron actividad antibacterial y antifúngica. Al parecer, la lisozima de frijol mungo es más eficaz para inhibir Fusarium solani y Botrytis cinerea. Además, pudo interrumpir en el crecimiento radial de F. solani e indujo anormalidades en su estructura celular, como desprendimiento de la membrana celular y la pared celular de la hifa, así como fugas de su citoplasma, lo cual sugiere la función vital de la lisozima en los mecanismos constitutivos de defensa del hospedante contra patógenos microbianos (Wang et al., 2005). Una lisozima aislada y purificada del tejido de una planta de coliflor afectó el crecimiento de hongos fitopatógenos y bacterias como F. solani y Erwinia carotovora, que normalmente infectan este cultivo (^{Manikandan et al., 2015}).

Con respecto a la actividad contra hongos fitopatógenos, Acremonium obclavatum mostró una mayor sensibilidad a la enzima, seguida de Leptosphaeria maculans y Alternaria alternata (^{Manikandan et al., 2015}). Todos estos estudios sugieren que las lisozimas de tejido vegetal y de insectos inhiben el desarrollo de bacterias y hongos. Sin embargo, en algunos casos, la actividad antibacterial de la lisozima de huevo de gallina sigue siendo más eficaz que la de otros tipos de lisozima previamente reportadas. Aunque ya se ha esclarecido el mecanismo de acción asociado a la actividad antibacteriana de la lisozima, a la fecha existe poca información acerca del mecanismo exacto de acción que las lisozimas siguen para dañar la superficie de la célula fúngica (^{Hernández-Téllez et al., 2018}; ^{Wu et al., 2017}).

Una lisozima aislada de semillas de Pithecellobium dulce ejerció actividad antifúngica contra Macrophomina phaseolina, con una alta estabilidad térmica de hasta 80 °C por 15 min y pH=8.0 (^{Sawasdipuksa et al., 2011}). También se ha reportado la actividad de la lisozima de clara de huevo de pollo en el crecimiento de hongos dimórficos como Paracoccidioides brasiliensis (^{Lopera et al., 2008}) y el efecto antibiopelícula en Candida albicans (^{Sebaa et al., 2017}). Cuando se expusieron células de levadura de P. brasiliensis a la lisozima, la capacidad de gemación múltiple disminuyó. Asimismo, se observaron cambios ultraestructurales como la fusión de vacuolas lípidas, estructuras laminares, degradación subcelular e interrupción de las capas fibrilares en los conidios después de su exposición a la enzima. Por tanto, la lisozima parece ejercer una doble función como parte de los mecanismos de defensa antifúngicos (Lopera et al., 2008). La lisozima humana mostró >80% de actividad antifúngica contra Aspergillus fumigatus, Penicillium sp., Acremonium sp., Candida parasilopsis y C. albicans, que comúnmente se identifican en pacientes con rinosinusitis crónica (^{Woods et al., 2011}).

Se ha sugerido que la lisozima puede hidrolizar los enlaces (β-1,4)-glicosídicos entre los monómeros N-acetilglucosamina que integran la quitina, afectando la función de la pared celular (^{Sowa-Jasiłek et al., 2016}; ^{Hernández-Téllez et al., 2018}). Sowa-Jasiłek et al. (2016) indicaron que la lisozima afectó el crecimiento de Candida albicans, ya que entra en un estado apoptótico, causado por una pérdida de la potencial membrana en la mitocondria; sin embargo, no describieron el mecanismo. También se observaron varios efectos nivel del núcleo de la célula, como la condensación de la cromatina y la fragmentación ADN. Hernández-Téllez et al. (2017, 2018) reportaron que las nanopartículas de quitosano-lisozima y sus componentes por separado pudieron interrumpir la primera etapa del crecimiento de Aspergillus parasiticus. Los autores encontraron bajos porcentajes de viabilidad celular en concentraciones de partículas de 200 a 300 μg mL^-1. La germinación y el diámetro de las esporas, la producción de azúcares reductores y la integridad de la membrana también fueron afectadas.

Hasta ahora, los datos acerca de cómo el mecanismo de acción de la lisozima afecta el desarrollo fúngico siguen siendo insuficientes. Las afectaciones estructurales pueden estar relacionadas con la producción de β-1,3-glucanasa, lo cual coincide con la baja producción de azúcares reductores detectada en Aspergillus parasiticus después de su exposición a nanopartículas de quitosano-lisozima (^{Hernández-Téllez et al., 2017}). Cabe señalar que en la realización de estos estudios se han utilizando enzimas puras, sin combinarlas con otros agentes antimicrobianos y que, por tanto, es necesario, en primerer lugar, establecer cómo trabaja la enzima en los hongos y la levadura, con el fin de llevar a cabo su aplicación tecnológica en las industrias farmacéutica, alimentaria y agrícola.

Figure 6 Importancia y aplicación de lisozimas y materiales a base de lisozimas. 

Inmovilización de la lisozima en nanomateriales antimicrobianos a base de quitosano. La aplicación industrial de las enzimas se recomienda debido a su selectividad y especifidad en condiciones moderadas (Figura 6).

Además, las enzimas pueden mejorar un gran número de procesos industriales de manera sostenible e inocua para el medio ambiente, ya que su comportamiento podría reducir el uso de compuestos químicos, así como la toxicidad inherente que éstos generan durante las reacciones (^{Bilal e Iqbal, 2019}; ^{Wang y Jiang, 2019}). Sin embargo, todavía existen algunas desventajas para su aplicación en la industria, como los altos costos (dependiendo del proceso), la poca estabilidad operacional, la desactivación por algunos solventes y la falta de recuperación o reciclabilidad, entre otras.

Respecto a su origen biológico, las enzimas son solubles y podrían ser inhibidas por los sustratos y los productos de reacción, los metabolitos y otros compuestos en los medios (^{Bilal e Iqbal, 2019}). Una estrategia que se propone es la inmovilización de las enzimas en matrices poliméricas diseñadas para aumentar su actividad antibacterial y prolongar su actividad y eficacia. A la fecha, este procedimiento se ha realizado con diferentes soportes sólidos y esto ha permitido resolver con buenos resultados los problemas antes mencionados, pero a menor escala (^{Huang et al., 2012}; ^{Wang y Jiang, 2019}). La inmovilización puede mejorar el control de la reacción, evitar que la enzima contamine el producto, un factor que es particularmente relevante en la industria alimentaria, permitiendo el uso de diferentes reactores. La tecnología de inmovilización de las enzimas puede promover y mejorar la estabilidad de la enzima.

Asimismo, esto supone la reutilización de las enzimas inmovilizadas. La técnica de inmovilización puede utilizarse incluso en el aislamiento y purificación de enzimas. Adicionalmente, este proceso suele ser necesario cuando se quiere lograr un comportamiento óptimo en medios no acuosos (^{Bilal e Iqbal, 2019}). A la fecha, la estrategia más utilizada para inmovilizar enzimas es el uso de materiales sólidos preexistentes. Por tanto, se han recomendado muchos polímeros y sus derivados, incluidos el alginato, la celulosa, el dextrano, la agarosa, el agar-agar, la carragenina, la gelatina, la goma guar, la pectina, el quitosano y otros (^{Bautista-Baños et al., 2016}; Bilal e Iqbal, 2019).

Los métodos de síntesis que más se mencionan para la inmovilización de enzimas se pueden clasificar como físicos y químicos. En los métodos físicos, las enzimas se unen al soporte con enlaces de hidrógeno o por atrapamiento en la matriz del polímero, en tanto que en los métodos químicos las enzimas están estrechamente unidas en el soporte por enlaces covalentes (^{Bilal e Iqbal, 2019}). Cuando se utilizan estos métodos, la inmovilización de la enzima se lleva a cabo por medio de absorción en materiales insolubles, atrapamiento en redes de gel de polímeros, encapsulamiento, entrecruzamiento utilizando agentes bifuncionales, unión covalente a un vehículo insoluble y formación de agregados de enzimas por medio de entrecruzamiento. Por lo general, la inmovilización de la enzima proporciona una mejor accesibilidad y estabilidad adicional en los procesos de desnaturalización. Las enzimas inmovilizadas han mostrado mayor estabilidad térmica y operacional al pH, las condiciones de temperatura extremas y los solventes orgánicos (Bilal e Iqbal, 2019). Sin embargo, existen todavía problemas prácticos que tienen que resolverse durante la inmovilización de la enzima, como la poca capacidad de carga en soportes sólidos, la baja tasa de recuperación y la pérdida de actividad enzimática causada por los inhibidores (^{Wang y Jiang, 2019}).

Es fundamental conocer la técnica correcta de inmovilización para, posteriormente, seleccionar la matriz de soporte y lograr la óptima inmovilización de la enzima. Es necesario verificar que la matriz de soporte de la enzima sea robusta y biocompatible con las características recuperables (^{Bilal e Iqbal, 2019}). Con este propósito, se han hecho extensos estudios sobre las matrices poliméricas naturales debido a sus características deseables, como no toxicidad, biocompatibilidad, biodegrabilidad, flexibilidad, sustentabilidad y el número de sitios reactivos disponibles (Bilal e Iqbal, 2019; ^{Wang y Jiang, 2019}).

El quitosano es un polímero ampliamente utilizado, que cumple con todas estas características que lo hacen atractivo para la industria alimentaria, productos farmacéuticos, electroquímicos, biosensores, textiles y recubrimientos (^{Hernández-Téllez et al., 2018}; ^{Wu et al., 2018b}). Se han preparado varios materiales a base de lisozimas y quitosano, a macro- y nano escala, cuyo uso se ha propuesto para inhibir o retardar el crecimiento microbiano. Entre estos materiales, se han estudiado mezclas de soluciones, hidrogeles, fibras y nanofibras, y nano- y micropartículas (Hernández-Téllez et al., 2018; Wu et al., 2018b; ^{Yu et al., 2018}). La matriz que más se ha reportado por lograr la inmovilización de la enzima es el quitosano; la inmovilización se realizado por medio de la interacción electrostática entre las cargas positivas del quitosano y la carga negativa del tripolifosfato (TPP) (Yu et al., 2018). Sin embargo, la incorporación de otros contraiones, como el alginato de sodio, el carragenano y el glutaraldehído, ha permitido la síntesis de estos materiales, sin que pierdan su actividad biológica (Hernández-Téllez et al., 2018; ^{Wu et al., 2018c}).

Otro aspecto que cabe destacar es que, debido a la complejidad del aislamiento y la purificación de las enzimas de fuentes naturales, estos materiales suelen ser sintetizados con lisozimas comerciales de clara de huevo de pollo, reduciendo su aplicación en la actividad biológica (Cuadro 2). Algunos reportes sugieren que las lisozimas aisladas de plantas, ya sea si son de tipoc o de tipo-i, pueden afectar una amplia diversidad de hongos, especialmente especies fitopatógenas, donde las enzimas fue aislada (^{Wang et al., 2005}; ^{Manikandan et al., 2015}). Aunque en los últimos años se ha hecho mucho más investigación sobre el quitosano y la lisozima, hoy en día, los materiales funcionales generados a base de éstos han abierto una nueva línea de investigación en todo el mundo.

Conclusiones y perspectivas. Las lisozimas están presentes en una gran variedad de organismos vivientes y, de manera notable, desempeñan una función importante en el sistema inmunológico, la digestión y la nutrición. Hoy en día se sabe que las lisozimas y las enzimas tipo lisozima pueden inhibir el crecimiento bacterial y afectar el desarrollo de hongos y levaduras. Los mecanismos de acción para inhibir el desarrollo de hongos y bacterias que se han reportado incluyen agregación en la superficie de la célula y, posteriormente, la actividad de la muramidasa y/o isopeptidasa, que afecta importantes proteínas y polisacáridos presentes en la pared celular. Sin embargo, todavía no se sabe muy bien de qué manera el mecanismo inhibe los polisacáridos de los hongos y la levadura. Aunque la lisozima de tipo-c es la que más se utiliza con propósitos antimicrobianos, otros tipos de lisozima manifiestan esta actividad. Por esta razón, es necesario estudiar cuidadosamente todos los tipos de lisozimas y las enzimas tipo lisozima, en particular las de plantas e insectos, ya que pueden afectar no solo a las bacterias sino también a los hongos patógenicos y a levaduras. Con base en una revisión de literatura, se ha propuesto la producción de micro- y nanomateriales formulados con estas enzimas antimocrobianas y matrices poliméricas, y estas últimas con polímeros policatiónicos como el quitosano. Dado que se espera que esta combinación pueda actuar de manera signérica en la preservación de alimentos, la protección de cultivos y formulaciones farmacéuticas, es además indispensable estudiar las implicaciones de su aplicación en el laboratorio y a niveles más altos, específicamente, en materiales destinados al control de hongos fitopatógenos.