Sitio de Estudio

La presente investigación se realizó se realizó bajo condiciones controladas en el laboratorio de microbiología perteneciente a la Universidad Técnica Estatal de Quevedo, localizado en el campo universitario “Manuel Haz Álvarez” ubicado en el km 1.5 vía Quevedo - Santo Domingo y en la Finca Experimental “La María”, perteneciente a la misma universidad y ubicada en el km 7.5 de la vía Quevedo-El Empalme, provincia de Los Ríos, Ecuador.

Material Genético

Se utilizaron semillas certificadas de pepino de la variedad Marketmore obtenidas del proveedor Agripac^® en la ciudad de Quevedo, Ecuador.

Tratamientos Homeopáticos

Se evaluaron cuatro medicamentos homeopáticos, cada uno en dos diferentes dinamizaciones centesimales (6CH y 12CH), de marca Similia^® con registro y autorización de la Secretaría de Salud de México para uso en humanos. Estos medicamentos fueron obtenidos de la Farmacia Homeopática Nacional (FHN^®, CDMX): Silicea terra (SiT-6CH y SiT-12CH), Natrum muriaticum (NaM-6CH y NaM-12CH), Magnesia phosphorica (MaP-6CH y MaP-12CH) y Arsenicum album (ArA-6CH y ArA-12CH). Los tratamientos homeopáticos (7CH y 13 CH) fueron preparados en la UTEQ, a partir de las dinamizaciones comerciales de FHN (6CH y 12CH; Similia^®, México) mediante dilución centesimal (1:99) y dinamización (2 min) con equipo vórtex, utilizando agua destilada y desionizada como vehículo de dilución/agitación. Lo anterior se hizo, con la aplicación de procedimientos básicos de homeopatía (^{Mazón-Suástegui et al., 2017}, ^2018a, ^b, ^2019a, ^b; ^{Ortiz-Cornejo et al., 2017}) y metodologías descritas en la Farmacopea Homeopática de los Estados Unidos Mexicanos (^{SSA, 2015}).

Diseño Experimental

Se aplicó un diseño completamente al azar con arreglo factorial (2A×4B+1), considerando las dinamizaciones homeopáticas 7ª y 13ª centesimal como factor A (7CH y 13CH) y los medicamentos homeopáticos como factor B (SiT, NaM, MaP y ArA). Se dispuso en total de ocho tratamientos homeopáticos y un tratamiento control, cada uno con tres repeticiones: T1: SiT-7CH; T2: NaM-7CH; T3: MaP7-CH; T4: ArA-7CH; T5: SiT13-CH; T6: NaM-13CH; T7: MaP-13CH; T8: ArA-13CH y T9: Control (Agua purificada).

Durante la etapa de germinación se utilizaron cajas Petri estériles, colocando en la base interior una capa de papel filtro a manera de sustrato y para conservar la humedad. Se emplearon 60 semillas por tratamiento, colocando 20 semillas por repetición. Las semillas fueron sumergidas en cada uno de los tratamientos durante 20 min y posteriormente se colocaron en la caja Petri correspondiente. Las pruebas de germinación se realizaron en oscuridad. Las semillas se consideraron germinadas cuando la radícula presentó alrededor de 2 mm de longitud (^{ISTA, 2010}). Durante la etapa de emergencia, se empleó la misma cantidad de semillas que en la etapa anterior, pero en este caso se sembraron en cajas germinadoras de espuma-flex con 30% de sustrato comercial NOVARBO^®, Finlandia y 70% de tierra negra, colocando una semilla en cada una de las cavidades, a 1cm de profundidad. Las semillas se consideraron emergidas cuando la plántula surgió a través de la superficie del sustrato. La evaluación del desarrollo vegetativo se realizó en macetas plásticas con el sustrato antes descrito, utilizando 45 plántulas por tratamiento, tratadas previamente con las medicamentos homeopáticos, tal como se indica en la etapa anterior. El riego se realizó cada dos días; 10 días después de la siembra se procedió a asperjar los tratamientos tanto en la parte aérea (tallo y hojas) de la planta como en el sustrato; la aspersión se realizó todos los días en las primeras horas (08:00) de la mañana. El tutorado se realizó 21 días después de la siembra y las biometrías 55 días después de la siembra.

Variables Evaluadas

La tasa y porcentaje de germinación se determinó durante 24 horas aplicando la fórmula propuesta por ^{Maguire (1962)}. Al finalizar los experimentos, las plantas se trasladaron al laboratorio donde se separó raíz, tallo y hojas para evaluar la morfología, se midió longitud de tallo (LT) y de raíz (LR), biomasa fresca y seca de parte aérea (tallo y hojas) (BFPa, BSPa) y de raíz (BFR, BSR). Para determinar peso fresco y seco de biomasa, se utilizó una balanza analítica (Mettler Toledo^®, modelo AG204, USA). Para obtener biomasa seca, la biomasa fresca correspondiente en muestras por separado, se colocó en bolsas de papel que se introdujeron en una estufa de secado (Shel-Lab^®, modelo FX-5, serie-1000203, USA) a temperatura de 70 °C hasta obtener su deshidratación completa (aproximadamente 72 h). Adicionalmente, durante el desarrollo vegetativo se evaluó el diámetro de tallo (DT), número de hojas (nH),) y número de brotes florales (nF).

Análisis Estadístico

Los datos correspondientes a todas las variables morfométricas se sometieron al análisis de varianza y la prueba de Tukey al 95%, para establecer la diferencia estadística entre las interacciones de las diluciones y los medicamentos homeopáticos. Previamente se realizaron pruebas de normalidad y homocedasticidad. Se utilizó el software estadístico SPSS Ver.22 (IBM^®, Armonk, NY 2013).

Germinación

Se registraron diferencias significativas entre tratamientos, con respecto al porcentaje y tasa de germinación. Al aplicar el tratamiento basado en la 13ª dinamización centesimal (13CH) del medicamento homeopático Arsenicum album (ArA), se obtuvieron los valores más altos (53.33% y 9 semillas germinadas, respectivamente) en comparación al grupo control, con 40% y 4 semillas germinadas, respectivamente (Figura 1).

Figura 1: Tasa y porcentaje de germinación de semillas de pepino (Cucumis sativus L.), tratadas con cuatro medicamentos homeopáticos (SiT, NaM, MaP y ArA) en dos diferentes dinamizaciones (7CH y 13CH). Letras diferentes denotan diferencias significativas mediante la prueba estadística de Tukey (HDS). 

Lo anterior concuerda con los resultados de ^{Brizzi et al. (2000)} quienes aplicaron diferentes dinamizaciones de ArA en semillas de trigo, demostrando efectos positivos con ese tratamiento. Así mismo, ^{Moreno et al. (2004)} indican que las ultra-diluciones de Arsenicum album promueven la germinación en semillas de café (Coffea arabica L.). Lo reportado por estos autores coincide con lo observado durante el presente estudio y sugiere que este medicamento tuvo un efecto similar, acelerando el proceso de germinación de las semillas de pepino (Cucumis sativus L.), lo que pudo ser a consecuencia de la presencia de nanopartículas del ingrediente activo del medicamento que desencadenaron o aceleraron los procesos fisiológicos a nivel celular (mecanismos aún por estudiar).

En cuanto a las variables morfométricas, también se observaron diferencias significativas entre las interacciones de tipo y dinamización de los medicamentos homeopáticos aplicados, con un coeficiente de variación de 7.30%. Para longitud de tallo (LT), se observó de manera general un efecto benéfico de todos los medicamentos homeopáticos, habiéndose obtenido el mayor crecimiento con MaP‑13CH (6.5 cm), en comparación con el grupo control (3.7 cm). El mismo efecto se observó en la longitud de la radícula (LR) con un coeficiente de variación de 4.55%. En todos los tratamientos homeopáticos se presentaron promedios similares (10 cm) y mayores al grupo control (8.4 cm). Este efecto benéfico podría estar relacionado con la naturaleza y origen del tratamiento MaP, puesto que el fosfato de magnesio se obtiene a partir de la saturación del ácido fosfórico transformado en sal de magnesio, un mineral de vital importancia en el desarrollo de las plantas ya que este elemento es el átomo central en la molécula de clorofila. La clorofila es el pigmento que da a las plantas su color verde y lleva a cabo el proceso de la fotosíntesis; también interviene en la activación de un sinnúmero de enzimas necesarias para su desarrollo y contribuye a la síntesis de proteínas. ^{Alvarado-Mendoza et al. (2017)} mencionan que el tratamiento homeopático MaP reduce la formación de esporas del hongo patógeno del tomate Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici.

Con respecto al peso fresco y seco, el porcentaje de variación para la parte aérea fue de 1.98 y 2.90%, respectivamente y para la radícula de 6.62 y 7.80%. Es importante observar que, de manera general, los mayores valores en peso se obtuvieron con SiT-7CH, NaM-7CH, MaP-7CH y ArA-13CH (Cuadro 1). Al respecto, ^{Pulido et al. (2017)} demostraron en sus investigaciones que las preparaciones homeopáticas de SiT y de Árnica montana aumentan la masa seca de brotes en plántulas de brócoli. Además, Almeida (2002)² registró un incremento en el peso fresco de albahaca (Ocimum basilicum L.) con la aplicación de preparados homeopáticos de SiT-30CH. Aquí es importante comentar, que la dinamización homeopática 12ª centesimal Hahnmannian (12CH) se ubica justo en el límite que establece la Teoría de Avogadro para que sea químicamente detectable la presencia de una molécula del “principio activo” del concentrado inicial o “Tintura Madre” (TM), a partir de la cual se elaboró el medicamento homeopático correspondiente mediante dilución y agitación serial (^{Mazón-Suástegui et al., 2019a}). Sin embargo, en estudios fisicoquímicos sobre medicamentos homeopáticos altamente diluidos, se ha demostrado sin duda alguna que existen nanopartículas del “principio activo” presente en la TM, incluso en dinamizaciones centesimales 30-CH y 200-CH (^{Chikramane et al., 2010}). Esta referencia y los resultados del presente estudio, demuestran que la medicación homeopática tiene un efecto biológicamente medible, más allá de un simple efecto placebo, que por otro lado, no podría existir en las plantas (^{Mazón-Suástegui et al., 2018a}, ^b, ^2019a, ^b). ^{Tichavsky (2007)} menciona la importancia del sílice y justifica la aplicación del medicamento homeopático Silicea terra (SiT) en las plantas, debido a que interviene directamente en su nutrición, disminuye el raquitismo y fortalece en lo general los tejidos de la planta. En lo relativo al medicamento NaM, elaborado a partir de sal marina, se ha demostrado que mejora el crecimiento de plantas de albahaca Ocimum basilicum L., bajo condiciones de estrés salino por adición de NaCl (^{Mazón-Suástegui et al., 2018b}). Por otra parte, se sabe que NaM-12CH incrementa los niveles de fósforo, hierro, sílice y potasio en las plantas (Gonçalves et al., 2012).

Emergencia

En relación al porcentaje de emergencia, se registraron diferencias significativas entre los tratamientos y el grupo control, principalmente en la tasa de emergencia (Figura 2) y los valores más altos (9.47 y 9.25 semillas por día, respectivamente) se registraron con el tratamiento MaP, con respecto al grupo control (8.3 semillas por día).

Figura 2: Tasa y porcentaje de emergencia de plántulas de pepino (Cucumis sativus L.) tratadas con cuatro medicamentos homeopáticos (SiT, NaM, MaP y ArA) en dos diferentes dinamizaciones centesimales (7CH y 13 CH). Letras diferentes denotan diferencias significativas mediante la prueba estadística de Tukey (HDS). 

En cuanto a las variables morfométricas evaluadas, se observó en lo general, e independientemente del medicamento homeopático aplicado, un mayor crecimiento en la LT de las plantas que fueron tratadas con la 7ª dinamización centesimal (7CH), con promedio de 12 cm, en comparación con la 13ª dinamización centesimal (13CH) con promedios de 10 cm. Al igual que durante la germinación, en el caso de la emergencia se obtuvieron los mejores resultados con MaP-7CH (12.3 cm), siendo superior a los demás tratamientos y al grupo control (9.9 cm). Para la LR no se encontraron diferencias significativas. Para la variable BFPa y BSPa, el mejor resultado se observó nuevamente con SiT-13CH, con promedios de 0.79 y 0.03 g, respectivamente, en comparación con el grupo control (0.47 y 0.02 g). En cuanto a la ganancia en peso de la raíz (BFR y BSR), los mayores valores se registraron con MaP-13CH (0.12 g) para peso fresco y NaM-13CH (0.0049 g) para peso seco, estadísticamente diferentes al grupo control que presentó valores de 0.04 g para BFR y 0.0017 g para BSR (Cuadro 2). El efecto de los tratamientos homeopáticos aplicados podría ser similar a lo observado durante la etapa previa de germinación.

Desarrollo Vegetativo

Durante el desarrollo vegetativo de las plantas se observaron diferencias significativas en todas las interacciones (medicamento homeopático × dinamización centesimal) evaluadas. Para LT, con la aplicación de NaM-13CH se observaron plantas con mayor longitud (117.07 cm), seguido de NaM-7CH, SiT-13CH y ArA-13CH, en comparación con el resto de los tratamientos y el grupo control (78.63 cm). El medicamento homeopático Natrum muriaticum se produce a partir de sal de mar, que contiene casi un 100% cloruro de sodio, pero también todas las diversas sustancias, compuestos y elementos que contiene el agua de mar (^{Mazón-Suástegui et al., 2018b}; ^2019a). Este medicamento permite al organismo tratado (animal o vegetal), asimilar, regular y conservar el contenido de otras sales, e interviene en la absorción de agua por parte de la planta y en el equilibrio osmótico de los líquidos contenidos en sus células y tejidos (^{Tichavsky, 2007}). Así mismo, ^{Maute (2011)} destaca que el medicamento Arsenicum album (ArA) ha sido ampliamente utilizada en la homeopatía agrícola, por su acción benéfica en el fortalecimiento y desarrollo de plantas debilitadas a causa de estrés hídrico. A pesar de que las plantas de pepino que fueron objeto del presente estudio no se sometieron a estrés hídrico, el efecto positivo registrado sobre la longitud de la planta pudo ser causado por la acción benéfica de los tratamientos homeopáticos aplicados, siguiendo un proceso similar al descrito anteriormente. Para longitud de raíz (LR), los valores más altos se obtuvieron con SiT-7CH (49.56 cm), seguido de ArA-7CH (41.27 cm) y NaM-3CH (37.21 cm), con respecto al grupo control (28.60 cm). ^{Pulido et al. (2017)} indican que al aplicar dinamizaciones ultra-diluidas más allá del límite que establece la Teoría de Avogadro (1×10^-23), del medicamento Silicea terra 30CH, se incrementa la longitud de raíz y la masa radicular seca de plantas de brócoli cultivadas en condiciones de invernadero. En lo referente a peso fresco y seco (BFPa, BSPa, BFR y BSR), se obtuvieron diferencias significativas entre los factores evaluados. Para BFPa se obtuvieron plantas con mayor peso (30.80 g) con la aplicación de NaM-13CH con respecto al grupo control (17.73 g), mientras que para la variable BSPa los valores mayores se obtuvieron, de igual forma, con NaM-13CH (2.46 g), con respecto a las plantas tratadas con agua purificada (Control; 1.20 g). En cuanto al peso de la raíz, las plantas que fueron tratadas con SiT-7CH, presentaron mayor peso fresco y peso seco (5 y 0.31 g respectivamente), con respecto al grupo control con 2.6 y 0.16 g, respectivamente (Cuadro 3).

Con respecto al diámetro del tallo, las plantas tratadas con NaM-7CH) presentaron el mayor diámetro promedio de tallo (5 mm), sin diferir estadísticamente de las plantas tratadas con Silicea terra (SiT-7CH) con un promedio de 4.64 mm, con respecto al grupo control (3.66 mm). Con relación al número de hojas por planta, la interacción NaM-3CH presentó el mayor valor promedio (13 hojas), estadísticamente diferente al grupo control (8 hojas). Con respecto al número promedio de flores por planta, el mejor resultado se obtuvo con la aplicación de NaM-7CH ya que se registraron casi el doble de flores por planta (61), con respecto al grupo control (33) (Cuadro 4). Estudios realizados con Natrum muriaticum demuestran que muy altas dinamizaciones (200CH) de este medicamento homeopático tienen la capacidad de inducir respuestas biológicas medibles en plantas, promoviendo un aumento en la cantidad de clorofila, una mayor acción de la enzima RUBISCO y un mayor contenido de proteína total en plantas de frijol caupí Vigna unguiculata cultivadas bajo estrés salino (^{Mondal et al., 2012}). Esto confirma el principio de los similares, que es básico en la teoría y práctica de la medicina homeopática, en el sentido de que la aplicación de pequeñas dosis de sustancias ultra-diluidas y dinamizadas mediante un proceso serial de dilución/agitación, puede prevenir o revertir los efectos nocivos de la misma sustancia cuando ésta es aplicada en dosis masiva (^{Mazón-Suástegui et al., 2017}; ^2018a; ^2019a). Por otro lado, al aplicar medicamentos homeopáticos es necesario considerar un efecto primario del medicamento per-se, y otro efecto secundario asociado a la esfera de acción de la dinamización aplicada. Existen diversas referencias sobre el efecto de la medicación homeopática en el incremento en peso de otras especies de plantas. ^{Sánchez y Meneses (2011)} demostraron que al aplicar el medicamento Calcárea fluorica 30CH se incrementó el peso del cebollín (Allium fitolosum), pero al aplicar la 30ª dinamización centesimal (30CH) de otro medicamento homeopático (Calcárea carbónica), se registró un efecto contrario, reflejado en la disminución del peso, en la misma especie.