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Introducción
Hibiscus sabdariffa L., conocida en México como jamaica es un arbusto de cultivo anual que pertenece a la familia de las Malváceas (Sáyago-Ayerdi et al., 2007). En México, los cálices de la planta se utilizan en la preparación de una bebida refrescante ampliamente consumida por la población, lo que le confiere importancia tanto económica como cultural (Sáyago-Ayerdi et al., 2007). La producción nacional es insuficiente y se importa al menos el 50 % de la jamaica que se consume. En Latinoamérica es usada como alimento y fuente de fibra dietética (Da-Costa-Rocha et al., 2014).
Los cálices de jamaica han sido reconocidos como una fibra dietética (FD) antioxidante (Sáyago-Ayerdi et al., 2014) ya que, además del alto contenido de FD, presenta compuestos antioxidantes con efectos anti-hipertensivos, anti-hipercolesterolémicos y anticancerígenos (Lin et al., 2011). Los principales compuestos bioactivos identificados en los cálices son delfinidin-3-glucósido, sambubiósido, cianidina-3-sambubiósido, flavonoides (gosipetina, hibiscetina) con sus respectivos glucósidos, ácido protocateico, eugenol, esteroles como β-sitoesterol, y ergoesterol (Ali et al., 2005; Babalola et al., 2001). Debido al potencial efecto benéfico de la jamaica, así como a su creciente uso en la preparación de alimentos, es importante cuantificar los principales constituyentes químicos, explorar nuevas propiedades biológicas y realizar estudios con variedades registradas (Zhen et al., 2016). Torres-Morán et al. (2011) mencionan que los marcadores moleculares y fenotípicos son cruciales para la caracterización de nuevos genotipos, para la planificación y siembra de cultivos, así como para el registro de nuevas variedades.
El Sistema Producto Jamaica, S.C. e instituciones gubernamentales como SAGARPA y CONACYT buscan la mejora de variedades de jamaica con las mejores características agronómicas, nutricionales y un mayor contenido de compuestos bioactivos; para ello, se desarrolló un proyecto interinstitucional con este fin. El objetivo de esta investigación fue determinar la composición química, el contenido de compuestos bioactivos y actividad antioxidante de 20 variedades mejoradas de jamaica cultivadas en México y seleccionar a través de estadística multivariada, aquellas con mejor composición química proximal y contenido de compuestos bioactivos.
Materiales y métodos
Material vegetal y preparación de la muestra
Para obtener las variedades mejoradas se llevó a cabo una fase de pre-cultivo durante varios años previos a este estudio (Caro-Velarde, Com. Pers.1). En el año 2014, 20 variedades de jamaica fueron sembradas y cosechadas en los estados de Nayarit (21° 39′ 15′′ N, 106° 32′ 45′′ O), Puebla (32° 33′ 52′′ N, 115° 21′ 12" O), Colima (19° 14′ 00′′ N, 103° 43′ 00′′ O) y Oaxaca (16° 00' 46′′ N, 97° 26' 15′′ O). Las variedades fueron proporcionadas por la Universidad Autónoma de Nayarit y los análisis se realizaron en el Instituto Tecnológico de Tepic. Las 20 variedades analizadas y su lugar de origen se presentan en el Cuadro 1. Tres lotes de 100 g de cálices secos enteros de cada variedad proporcionada fueron homogenizados en un molino (IKA, M20, USA), tamizados a 500 μm y almacenados en recipientes herméticos a -20 °C hasta su análisis.
Los valores son las medias de tres repeticiones. Letras diferentes por columna indican diferencia significativa utilizando ANOVA de una vía y la prueba Fisher LSD para comparación de medias (P ≤ 0.05). Humedad, cenizas, proteínas, lípidos, carbohidratos totales (CT), fibra dietética soluble (FDS), polisacáridos no amiláceos de la fibra dietética insoluble (PNA-FDI), lignina Klason de la fibra dietética insoluble (LK-FDI), fibra dietética total (FDT), y taninos condensados (TC) fueron expresados como g TC/100 g bs. Polifenoles extraíbles (PE) y Polifenoles Hidrolizables (PH) fueron expresados como mg Equivalentes de Ácido Gálico g-1 bs. Actividad anti-radical (ABTS) y actividad quelante (FRAP) fueron expresados como mM Equivalentes Trolox g-1 bs.
Cuadro 1 Composición proximal, contenido de compuestos bioactivos y actividad antioxidante de 20 variedades mejoradas de jamaica cultivadas en México.
Composición química
El contenido de humedad, proteína cruda, grasa y cenizas se determinó de acuerdo con los métodos oficiales; 925.09, 920.87, 920.39 y 923.03, respectivamente de la AOAC (1990). La evaluación de carbohidratos totales se llevó a cabo por el método Fenol-Sulfúrico propuesto por Dubois et al. (1956) y la fibra soluble, insoluble y total se evaluó con el método 991.42 de la AOAC (1990), con las modificaciones propuestas por Mañas y Saura-Calixto (1995).
Extracción acuoso-orgánica
Previo a la cuantificación se realizó una doble extracción acuoso-orgánica de los cálices a partir de la metodología propuesta por Pérez-Jiménez et al. (2009). Una solución metanólica acidificada (metanol:agua, 50:50 v/v, HCl 2 N) y una solución de acetona-agua (70:30 v/v) fueron utilizadas. En cada extracción, los tubos se centrifugaron a 8000 Xg durante 10 min a 4 °C. Los sobrenadantes de cada extracción fueron recuperados y mezclados para ser utilizados en la cuantificación de polifenoles extraíbles (PE) y de la actividad antioxidante (AOX). Los PE se determinaron de acuerdo con el ensayo de Folin-Ciocalteu del método propuesto por Montreau (1972), modificado por Alvarez-Parrilla et al. (2010).
Una muestra de 250 μL, 1000 μL de solución de carbonato de sodio (75 g L-1) y 1250 μL del reactivo Folin-Ciocalteu (100 mL L-1) fueron mezclados y puestos en reposo (15 min, 50 °C), cuya absorbancia se midió a 750 nm con un lector de microplaca (Biotek, Synergy HT®, Winooski VT, USA) con el programa BioTek Gen5 (Version 2.0 Data Analysis Software. Winooski, VT, USA), y los resultados fueron expresados en mg equivalentes de ácido gálico (mg EAG g-1 bs) al haber utilizando ácido gálico (0 a 0.2 mg mL-1) como curva estándar.
Por otro lado, los residuos de la extracción fueron utilizados para cuantificar los polifenoles no extraíbles (PNE) conformados por polifenoles hidrolizables (PH) y taninos condensados (TC). Para la determinación de PH los residuos se hicieron reaccionar con metanol-H2SO4 (85 °C, 20 h) y posteriormente se centrifugaron (8000 Xg, 10 min) (Hartzfeld et al., 2002); los sobrenadantes se separaron, lavaron con agua destilada, se volvieron a centrifugar y a mezclar con los sobrenadantes y finalmente se cuantificaron los PH (Montreau, 1972); los resultados se expresaron en mg de equivalentes de ácido gálico, mg EAG g-1 bs. Los TC fueron analizados en los residuos de la extracción, que se hidrolizaron con butanol-HCl-FeCl3 (3 h, 100 °C), centrifugados (8000 Xg, 10 min) y los sobrenadantes fueron recuperados (Reed et al., 1982). La concentración de TC se evaluó frente a un estándar de algarroba (Ceratonia siliquia) a 555 nm y se expresó como mg TC 100g-1 bs.
Evaluación de la actividad antioxidante
Los sobrenadantes de la extracción acuoso-orgánica se utilizaron para evaluar la AOX en las variedades, con dos métodos que se describen a continuación:
Poder antioxidante reductor de hierro (FRAP)
Se utilizó el método propuesto por Benzie y Strain (1996), de modo que el FRAP se preparó en proporción 25:2.5:2.5 de buffer de acetato de sodio 0.3 M, pH 3.6, TPTZ-HCl [que contenía 10 mM 2, 4, 6-tri-(2-piridil)-s-triazina en 40 mM HCL] y cloruro férrico hexahidratado (20 mM), respectivamente. La AOX se determinó a 595 nm durante 30 min, con un lector de microplacas de detección múltiple (Biotek®, Synergy HT, Winooski, VT, USA) con el programa BioTek Gen5. Los resultados fueron expresados en equivalentes Trolox (ET; mM g-1 bs) con una curva estándar (8.125 x 10-3 0.13 mM Trolox).
Análisis del ácido 2,2'-azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS)
Para este ensayo se utilizó el método propuesto por Re et al. (1999). La actividad anti-radical se evaluó mediante la mezcla de 20 μL de los extractos con 255 μL de ABTS a una temperatura de 30 °C durante 7 min utilizando un lector de microplacas de detección múltiple (Biotek®, Synergy HT) y con el programa BioTek Gen5. La disminución en la absorbancia se midió a 734 nm. Se utilizó una curva estándar entre 37.5 a 600 μM de Trolox y los resultados se expresan en equivalentes de Trolox (ET; mM g-1 bs).
Análisis de datos
Los resultados analíticos se expresaron como media ± DE (desviación estándar, n = 3). Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía y una prueba LSD de Fisher (P ≤ 0.05) a todas las variables, y posteriormente se hizo un análisis de componentes principales (ACP); se obtuvieron las puntuaciones factoriales y se clasificaron mediante un análisis de conglomerados jerárquico (ACJ) con el método de amalgamamiento simple, con el programa Statistica Version 10.0 Data Analysis Software (StatSoft®, Inc., Tulsa, USA).
Resultados y discusión
Composición proximal de los cálices de Jamaica
Los resultados obtenidos del análisis de composición proximal en los cálices de 20 variedades mejoradas de jamaica se muestran en el Cuadro 1. Las muestras estudiadas presentaron diferencias significativas (P ≤ 0.05). El contenido de humedad para 17 de las 20 variedades se encontró dentro de la Norma Mexicana NMX-FF-115-SCFI (Secretaría de Economía, 2010), la cual establece que este parámetro no debe ser superior a 12 % a fin de evitar contaminación microbiana. Las variedades Tempranilla Roja, UAN 10-1 y UAN 12-1 obtuvieron valores superiores a los señalados en la Norma Mexicana (14.73, 16.04 y 15.71 % respectivamente), lo que pudo deberse al proceso de secado poscosecha de los cálices frescos (Caro-Velarde et al., 2010) ya que éstos fueron entregados secos para su análisis.
El contenido de cenizas se encontró en un intervalo de 6.14 a 10.87 g/100 g bs, valores que son similares a los reportados por Ali et al. (2005) (9.75 g 100/g bs) y por Sáyago-Ayerdi et al. (2014) (12.4 g 100/g bs). En este sentido, Crisosto y Mitchell (2002) explicaron que la absorción de minerales en la planta está influenciada por varios factores tales como edad, densidad, distribución del sistema radical, grado de disolución de los propios minerales, humedad y pH del suelo, así como por los requerimientos nutrimentales de cada variedad. Por otro lado, el contenido de proteína en la variedad Cruza Negra (14.70 g/100 g bs) fue significativamente mayor (P ≤ 0.05) al de las otras variedades.
El contenido de lípidos fue alrededor al 1 g 100/g bs y fue la variedad Cruza Negra la que obtuvo el menor contenido (0.06 g/100 g bs). En carbohidratos totales, las variedades Cruza Negra y UAN 30, presentaron los valores más altos (>39 g/100 g bs). Las diferencias en el contenido de estos compuestos pueden deberse al ciclo fotosintético de cada una de las variedades, el cual está influenciado por factores como el estrés hídrico, la estructura de las hojas, contenido de clorofila, calidad y cantidad de luz incidente en las hojas y la temperatura ambiente (Evans y Al-Hamdani, 2015); asimismo, la alta variabilidad en la composición de estos cultivos puede depender de factores geográficos y genéticos (Kader, 2002; Vicente et al., 2009).
Contenido de fibra dietética soluble (FDS), insoluble (FDI) y total (FDT)
El contenido de FD se muestra en el Cuadro 1, donde los valores más altos en el contenido de FDS fueron para las variedades 4Q4, UAN 10-1 y UAN 12-1 (10.07, 9.77 y 9.73 %, respectivamente). En cuanto a la FDI el valor más alto se obtuvo en las variedades UAN 26 y Puebla Precoz; en general, en todas las variedades estudiadas corresponde al 75 % de la FDT. Las variedades con mayor contenido de FDT fueron UAN 16-1, UAN 26, Puebla Precoz y 2Q3 (> 41 %). La relación 25:100 FDS/FDT encontrada en todas las variedades de jamaica tiene una gran importancia desde el punto de vista funcional, ya que la FDI ayuda a la motilidad intestinal y la FDS influye en la disminución del vaciamiento gástrico, envía señales de saciedad e incrementa la viscosidad en el intestino delgado; también sirve de sustrato fermentativo para la microbiota colónica (Lunn et al., 2007).
Contenido de polifenoles extraíbles (PE), polifenoles hidrolizables (PH), taninos condensados (TC) y actividad antioxidante (AOX)
Las variedades presentaron diferencia significativa (P ≤ 0.05) en todas las variables estudiadas (Cuadro 1). En las variedades UAN 26 y UAN 6-1 se encontró el mayor contenido de PE (53.23 y 50.19 mg EAG g-1 cálices bs, respectivamente) y la variedad Criolla Súper Precoz presentó el menor contenido de PE (25.03 mg EAG g-1 cálices bs). Los PE se relacionan con la pigmentación del cáliz, atribuida principalmente al contenido de antocianinas, compuestos responsables de la coloración rojo oscuro (Jackson, 2009).
En cuanto al contenido de PH, la variedad UAN 16-1 obtuvo el valor más alto (14.16 mg EAG g-1 bs), seguida de la variedad 4Q4 (13.56 mg EAG g-1 bs). Los PH están conformados por galotaninos y elagitaninos en cálices completos de jamaica, y se ha identificado ácido cafeico como parte de los PH liberados durante la hidrólisis (Mercado-Mercado et al., 2015). Por su parte, los TC o proantocianidinas, como las catequinas, provienen de la esterificación de flavonoides. La variedad que presentó mayor contenido de TC fue la variedad UAN 16-1 (8.31 mg TC g-1). La hidrólisis de estos compuestos produce antocianidinas o cationes flavilium de coloración rojo intenso (Vázquez-Flores et al., 2012).
La AOX evaluada a partir de la inhibición del radical ABTS presentaron diferencia significativa (P ≤ 0.05) (Cuadro 1). Las variedades UAN 26 y 2Q3 obtuvieron los valores más altos (630.15 y 585.47 mM ET/100 g bs, respectivamente). La AOX evaluada por el método FRAP, que representada como la capacidad de reducir Fe3+ a su forma Fe2+, registró los valores más altos en las variedades UAN 26 y Puebla Precoz (422.15 y 378.95 mM ET/100 g bs, respectivamente). En ambos métodos (ABTS y FRAP), las diferencias pueden ser atribuidas a factores genéticos propios de cada variedad y al contenido de PE en los extractos (Fernández-Arroyo et al., 2011; Wong et al., 2009). La relación directamente proporcional entre el contenido de polifenoles y la AOX se observó en la variedad UAN 26, donde se presentó el mayor contenido de PE (53.23 mg EAG g-1 cálices bs) y la mayor AOX por ambos métodos (ABTS: 630.15 y FRAP: 422.15 mM ET g-1 muestra seca).
Análisis de componentes principales
El ACP se aplicó para determinar los patrones de reconocimiento en las muestras de jamaica. Cinco componentes principales con valores propios ≥ 1 explicaron 81.2 % de la varianza total. Las cargas factoriales y las puntuaciones factoriales de los cinco componentes principales se presentan en la Figura 1 (A) y (B), respectivamente. El primer componente contribuyó con 32.66 %, el segundo con 19.60 %, el tercero con 12.38 %, el cuarto con 9.06 % y el quinto con 7.77 %.
Figura 1 Análisis de componentes principales. A) cargas factoriales y B) puntuaciones factoriales para las 20 variedades mejoradas de Hibiscus sabdariffa L. cultivadas en México.
El CP 1 se encuentra caracterizado por un mayor contenido de proteína y menor contenido de CT, PH, TC, ABTS, FRAP, PE, FDT y FDI. El CP 2 presentó mayor contenido en TC, PH y LK-FDI y menor contenido de lípidos, cenizas, FDT y PNA-FDI. El CP 3 presentó un mayor contenido de lípidos y menor contenido de proteínas. Por su parte el CP 4 está caracterizado por mayor contenido de FDS y menor contenido de LK-FDI. El CP 5 observó un mayor contenido de humedad y menor contenido de cenizas.
Análisis de conglomerados jerárquico (ACJ)
Las puntuaciones factoriales (Figura 1 B) en cada uno de los componentes obtenidos se usaron para clasificar a las 20 variedades mediante un ACJ efectuado con el método de amalgamamiento simple. El dendograma obtenido del ACJ se presenta en la Figura 2. Se obtuvieron 12 grupos de los cuales ocho se formaron por una sola variedad (G4: UAN 12-1, G6: UAN 16, G7: UAN 23, G8: Criolla Súper Precoz, G9: UAN 25-1, G10: UAN 30, G11: Cruza Negra y G12: UAN 16-1) lo que indica que se trata de variedades mejoradas de jamaica con características particulares. El G1 fue formado por las variedades 4Q4, Negra Quiviquinta, UAN 13. El Grupo 2 (2Q3, UAN 6-1, Puebla Precoz y UAN 12-1) presentaron el mayor contenido de lípidos, FDT, PE y AOX. De acuerdo con estos resultados, las variedades 2Q3, UAN 6-1, Puebla Precoz y UAN 12-1 (G2) presentan el mejor perfil de propiedades potencialmente funcionales; es decir, que pueden brindar mayores beneficios a la salud por su alto contenido de compuestos bioactivos, AOX y FDT.
Conclusiones
Las variedades mejoradas de H. sabdariffa presentan alta variabilidad en la composición química de los cálices. Las 20 variedades de jamaica fueron clasificadas en 12 grupos y cada variedad presentó características distintivas que se pueden utilizar como descriptores para diferenciarlas. Las variedades 2Q3, UAN 6-1, Puebla Precoz y UAN 12-1 (Grupo 2) mostraron características funcionales con potencial al presentar mayor contenido de compuestos bioactivos y AOX. Las variedades incluidas en el Grupo 2 podrían ser utilizadas como iniciadoras de nuevas cruzas en los programas de mejoramiento de jamaica. El conocimiento de las características nutricionales y propiedades nutracéuticas de la jamaica podrían ayudar al incremento de superficie del cultivo dentro de un mercado más competitivo en el consumo de alimentos funcionales.
