Diseño experimental y preparación de muestras

El suelo usado en los ensayos fue obtenido del horizonte A de un haplustox típico, franco arenoso, fuertemente ácido y pobre en nutrimentos (^{Hernández-Valencia y Mager 2003}), proveniente de la localidad de El Sombrero, estado Guárico, Venezuela. Por su parte, el petróleo utilizado presentó una gravedad específica de 9º API, por lo cual se le clasifica como extra pesado. Como planta con potencial fitorremediador se usó al pasto Megathyrsus maximus (Jacq.) B. K. Simon y S. W. L. Jacobs (guinea, gamelote), una gramínea perenne, de rápido crecimiento, introducida de África, pero de amplia distribución en Venezuela. Se utilizaron plantas con alturas entre 25-30 cm, obtenidas a partir de la germinación de semillas certificadas en suelos no contaminados.

Se establecieron dos tratamientos en condiciones de invernadero: a) suelo contaminado con 50.0 mg/g de petróleo extra pesado y con el pasto (CP), b) suelo contaminado con 50.0 mg/g de petróleo extra pesado sin el pasto (SP). El suelo contaminado fue una mezcla preparada con 85 % de suelo, 5 % de petróleo extra pesado y 10 % de cáscara de arroz (m/m) como agente estructurante, con mayor capacidad de retención de agua, y de mejorar la actividad microbiana (^{Infante et al. 2012}). Una cantidad de 2.5 kg de la mezcla de suelo, petróleo y cáscara de arroz fue colocada en envases cilíndricos de policloruro de vinilo (PVC) de 30 cm de alto y 10 cm de diámetro. En el tratamiento con el pasto se sembró un individuo de M. maximus por envase. Las condiciones microclimáticas promedio del invernadero durante el ensayo fueron 23.2 ºC de temperatura, 450 μ E/s de radiación y 85 % de humedad relativa. Para cada tratamiento se establecieron cinco réplicas y la duración del experimento fue de 120 días.

Todos los tratamientos fueron fertilizados con N:P:K: (15:15:15) y sulfato de amonio, en una relación C:N:P de 100:2:0.2, similar a la utilizada por ^{Hutchinson et al. (2001}). El fertilizante se incorporó un 50 % (1.772 g de N:P:K y 4.264 g de sulfato de amonio por envase) al inicio del ensayo, y el restante 50 % fue repartido equitativamente a los 30 y 60 días siguientes. Los envases fueron regados cada 5 d con agua del servicio doméstico, manteniendo el suelo a 50 % de su capacidad de campo. La capacidad de campo fue estimada por triplicado en una masa de suelo previamente contaminada con el petróleo extra pesado a la concentración de 50 mg/g, al cual se agregó agua hasta su saturación. Luego el suelo fue cubierto con un manto plástico para reducir las pérdidas de agua por evaporación y posteriormente se dejó drenar el excedente de agua durante 72 h. El agua retenida o capacidad de campo se estimó como la diferencia de masa entre el suelo húmedo luego de 72 h y el suelo seco, después de ser secado por 48 h a 105 º C en una estufa (^{Anderson e Ingram 1992}).

Determinación de hidrocarburos del petróleo y sus fracciones

Se colectaron muestras de los suelos de ambos tratamientos a los 0, 15, 30, 60 y 120 d de iniciado el ensayo para realizar determinaciones del contenido de hidrocarburos por el método EPA 3540C (^{USEPA 1996}), empleando como agente extractante diclorometano. Adicionalmente, a los extractos de hidrocarburos obtenidos al inicio y al final del ensayo de cada tratamiento se les hizo un fraccionamiento para determinar las variaciones en el contenido de saturados, aromáticos, resinas y asfaltenos (SARA), de acuerdo con el método 5520 (^{APHA 1998}), procedimiento que se basa en la separación de las diferentes fracciones del petróleo a través de técnicas de precipitación y adsorción, según la solubilidad y polaridad de dichas fracciones.

Determinación de indicadores de la actividad microbiológica en el suelo

Para las muestras de suelos obtenidas en cada muestreo se determinó la actividad de la enzima deshidrogenasa (ADH), el carbono de la biomasa microbiana (Cmic) y la respiración basal (RB). La actividad de la enzima deshidrogenasa se determinó según el método de ^{Casida et al. (1964}), el cual se basa en la reducción del cloruro de trifenil tetrazolio (TTC) por la acción de dicha enzima a trifenil formazan (TPF), lo que origina un precipitado de color rojo soluble en metanol. Se emplearon 1.5 g suelo en peso fresco que se colocaron en tubos de ensayo con 0.25 mL de TTC al 3 %, 0.05 g de CaCO₃ y 2.5 mL de agua destilada. Las muestras se incubaron por 24 h a 37 ºC y posteriormente se añadieron 2.5 mL de CH₃OH. Finalmente la muestra se filtró y se midió la absorbancia a 485 nm. Los patrones fueron preparados a partir de una solución estándar de TPF de 1mg/L.

Para la determinación del Cmic se empleó el método de fumigación-extracción según ^{Vance et al. (1987}) que estima este indicador como el contenido de carbono soluble en una solución de K₂SO₄ 0.5 M. Para ello se utilizaron muestras de 5 g de suelo a 50 % de su capacidad de campo, por sextuplicado para cada serie de tiempo. Tres réplicas se fumigaron con cloroformo libre de etanol en una cámara de vacío por 24 h con el fin de provocar la muerte de las células microbianas, mientras que las tres réplicas restantes no fueron fumigadas. El carbono de las muestras fumigadas y no fumigadas se extrajo con 40 mL de K₂SO₄ 0.5 M agitando durante 1 h. Posteriormente se tomaron 8 mL del extracto y se añadieron 15 mL de una mezcla ácida (2/3 partes de H₂SO₄ y 1/3 de H₃P0₄), 2 mL de K₂Cr₂O₇ 66.7 mM y 70 mg de HgO. La mezcla se colocó a digestión durante 30 min a 150 ºC y luego se valoró con sulfato amónico ferroso 33 mM empleando como indicador 1.10 fenantrolina-ferrosa 25 mM. La cantidad de carbono de la biomasa microbiana se determinó mediante la fórmula:

Donde K_ec = 0.38, es una constante de recuperación calculada a partir de la correlación de los resultados obtenidos en doce suelos diferentes en donde se utilizó este método (^{Vance et al. 1987}).

La respiración basal o CO₂ liberado por los microorganismos fue estimado por el método de ^{Alef y Nannipieri (1995}). Para cada tiempo se utilizaron 25 g de suelo al 50 % de capacidad de campo y se colocaron en envases de plástico con 50 mL de capacidad. En envases similares se colocaron 10 mL de NaOH 0.5 M como solución que absorbe el CO₂ emitido por los microorganismos. Ambos envases se colocaron dentro de un recipiente de vidrio herméticamente cerrado y fueron incubados en la oscuridad a 23 ºC durante 48 h. Transcurrido el tiempo de incubación se añadió a cada envase 1 mL de BaCl₂ 0.5 M para precipitar como carbonato al CO₂ fijado y el NaOH restante se valoró con HCl 0.5 M, utilizando como indicador fenolftaleina al 1%, disuelto en CH₃COH. Con los datos de respiración basal y Cmic se calculó el coeficiente metabólico (qCO₂ = RB/Cmic), que es una medida de la eficiencia con la cual los microorganismos utilizan el carbono disponible para la biosíntesis (^{Marín et al. 2005}).

Los resultados de los indicadores antes mencionados fueron expresados con base en el peso seco, luego de secar triplicados de las muestras de suelo en una estufa a 105 ºC por 48 h y pesadas en una balanza de 0.01 g de precisión.

Análisis estadísticos

Las medias de los tratamientos de los diferentes parámetros evaluados fueron comparadas a través de un análisis de varianza de dos vías y la prueba a posteriori de la mínima diferencia significativa (LSD, por sus siglas en inglés) de Fisher con un nivel de significancia del 0.05. También se realizaron pruebas de correlación lineal de las variaciones en el tiempo entre el contenido de hidrocarburos, respiración basal, Cmic, coeficiente metabólico y actividad de la enzima deshidrogenasa. Para todas las pruebas estadísticas se usó el programa Statistica 8.0 (^{Statsoft 2007}).

Contenido total y fraccionamiento de los hidrocarburos en el suelo

La figura 1 muestra los cambios en el contenido de hidrocarburos en el tiempo. Se debe mencionar que este método permite determinar tanto los hidrocarburos de tipo mineral, como vegetal y animal. Sin embargo, en vista de que análisis previos mostraron que el contenido de aceites y grasas en suelos no contaminados fue inferior a 5 mg/g, se desestimó la contribución de la fracción vegetal y animal, por lo que en consecuencia nos referiremos a los aceites y grasas extraídos en este estudio como a hidrocarburos del petróleo.

Fig. 1 Variación en el tiempo del contenido de hidrocarburos de petróleo. Letras minúsculas iguales indican que no hay diferencias para un mismo tratamiento en diferentes tiempos. Letras mayúsculas iguales indican que no hay diferencias entre tratamientos para un mismo tiempo. Las barras corresponden a la desviación estándar (n = 5) 

Destaca que la recuperación del petróleo del suelo no fue total; es decir, de la mezcla originalmente preparada de 50.0 mg/g de petróleo extra pesado, se obtuvo una concentración inicial de hidrocarburos del 37.5 mg/g, lo que implica una recuperación del 75 % aproximadamente. Este porcentaje de recuperación es similar a otros reportes en la literatura (^{Infante et al. 2012}, ^{Mager y Hernández Valencia 2013}), y se asocia con que el extractante no logra la desadsorción completa del petróleo por las interacciones con los componentes de mayor polaridad con la matriz del suelo y por la volatilización hidrocarburos de bajo peso molecular (^{Infante et al. 2012}, ^{Córdova et al. 2013} ). Con base en ello, se usó para los cálculos de disminución de la concentración de hidrocarburos en el tiempo, un valor inicial de 37.5 mg/g y no de 50.0 mg/g

Durante los 120 días del ensayo, el valor inicial de 37.5 mg/g de hidrocarburos disminuyó a 33.8 mg/g en SP y 31.1 mg/g en CP, siendo estadísticamente diferentes entre sí sólo a los 120 d (Fig.1). La mayor disminución del contenido de hidrocarburos en los primeros 15 d para ambos tratamientos se relaciona con la rápida degradación de los componentes más lábiles, como son los saturados y los aromáticos, las fracciones más biodegradables, pero también más toxicas respecto a las resinas y asfaltenos (^{Ehrmann et al. 2009}, ^{Infante y Morales 2012}). Posteriormente, a partir de los 15 d y hasta el término del ensayo, el tratamiento SP no evidenció una reducción significativa en el contenido de hidrocarburos.

La dinámica en el tiempo del contenido de hidrocarburos en el suelo para ambos tratamientos se ajustó a una curva exponencial negativa del tipo:

(1)

en donde Po y Pt es la masa inicial y remanente de hidrocarburos respectivamente, t es el tiempo transcurrido y k la constante de pérdida (^{Mager y Hernández Valencia 2013}). La ecuación anterior puede ser expresada también como:

(2)

Cuando los datos se ajustan al modelo, describen una recta cuya pendiente (k) es la constante de pérdida de los hidrocarburos. Una ventaja del ajuste de los datos a este modelo, es que permite calcular también el tiempo de vida media (0.693/k), así como la tasa de recambio o el tiempo requerido para que se degrade el 99 % (4.605/k) del contenido original de hidrocarburos (^{Mager y Hernández Valencia 2013}).

Sólo los datos de la variación en el tiempo en el contenido de hidrocarburos en CP se ajustaron al modelo exponencial negativo (r = -0.88, p = 0.05, n = 5). La constante de degradación (k) fue de -0.46, lo que permite estimar que bajo las condiciones de este tratamiento, la vida media y la tasa de recambio del petróleo utilizado son de 1.5 y 10.7 años respectivamente. La baja tasa de biodegradación de este tipo de petróleo se confirma cuando se contrasta con los resultados obtenidos por ^{Mager y Hernández-Valencia (2013}), quienes encontraron para la misma especie y suelos contaminados a 30.0 mg/g con un petróleo más liviano, de 27.2º API, que el tiempo de vida media y la tasa de recambio fueron de 0.5 y 3.1 años respectivamente. Evidentemente, las diferencias de estos resultados con los de nuestra investigación podrían justificarse por el hecho de que usamos un petróleo extra pesado, con mayor contenido de compuestos resistentes a la biodegradación, como resinas y asfaltenos, además en una concentración inicial en el suelo más alta , y en consecuencia un potencial más tóxico.

Respecto al uso de M. maximus en la recuperación de suelos contaminados con petróleo extra pesado, pese a que se encontraron diferencias significativas en los tratamientos con pastos a los 120 d, estas no fueron muy grandes respecto al tratamiento sin plantas, hecho que indica que en este caso el uso de fitorremediación no es tan eficiente, y en consecuencia pudieran proveer mejores resultados otras técnicas biológicas como la biorremediación con técnicas agrícolas (landfarming, en inglés) y el compostaje (^{Infante et al. 2010}a) e incluso en otras basadas en procesos físicos o químicos (incineración, lavado, uso de surfactantes) (^{Yavari et al. 2015}). Sin embargo, el uso de uso de M. maximus puede ser ventajoso si se implementa luego de usar estas técnicas, ya que el establecimiento de plantas con fines de fitorremediación mejora la calidad del suelo al aportar materia orgánica y fomentar la actividad biológica, además de remover compuestos contaminantes remanentes, proteger al suelo contra la erosión y procurar desde el punto de vista estético un entorno más agradable. Estos aspectos requieren mayores estudios en el futuro.

Dentro de las fracciones que componen los hidrocarburos extra pesados, las fracciones de saturados y aromáticos para CP y sólo la de aromáticos para SP disminuyeron a los 120 d (Fig. 2). Las resinas y los asfaltenos no mostraron cambios significativos, lo cual se asocia a su reconocida baja biodegradabilidad (^{Moubasher et al. 2015}). Se debe destacar que los aromáticos for man parte de las fracciones más tóxicas del petróleo (^{Płaza et al. 2005}). Por lo que su disminución es beneficiosa para el suelo y el ambiente en general. Dentro de la gama de compuestos aromáticos se encuentran los denominados hidrocarburos aromáticos policíclicos, siendo algunos de ellos cancerígenos (^{Rengarajan et al. 2015}).

Fig. 2 Concentraciones iniciales y finales de las fracciones de aromáticos, saturados, resinas y asfaltenos en suelos contaminados con petróleo extra pesado. Letras minúsculas iguales indican que no hay diferencias para una fracción en los diferentes tiempos. Las barras corresponden a la desviación estándar (n = 5) 

Respiración basal, actividad de la enzima deshidrogenasa y carbono de la biomasa microbiana

A los 0, 15, 30, 60 y 120 d no se registraron diferencias significativas en la respiración basal entre los tratamientos con y sin plantas (Fig. 3) y ello se asocia a la alta variabilidad de los datos. Resultados similares fueron obtenidos por ^{Besalatpour et al. (2010}), donde la presencia de Carthamus tinctorius , en suelos contaminados con 43.0 mg/g de petróleo no incrementó la producción de CO₂, aunque sí lo hizo en presencia de Agropyron smithii , Festuca arundinacea y Helianthus annus.

Fig. 3 Variaciones de la respiración basal. Letras minúsculas iguales indican que no hay diferencias para un mismo tratamiento en diferentes tiempos. Letras mayúsculas iguales indican que no hay diferencias entre tratamientos para un mismo tiempo. Las barras corresponden a la desviación estándar (n = 5) 

En CP la respiración basal fue mayor a los 15 d respecto a los 120 d. Lo que sugiere que la actividad de los microorganismos se ve inicialmente favorecida por la presencia de raíces, sus exudados y el carbono proveniente de los hidrocarburos. Posteriormente tiende a disminuir en la medida que lo hacen los hidrocarburos, especialmente aquellas fracciones biodegradables, hecho ya reportado por otros autores en diferentes suelos y tipos de hidrocarburos sin plantas ( ^{Infante et al. 2010}b, ^{Riveroll-Larios et al. 2015}). En el caso de SP no se encontraron cambios significativos en la respiración basal a los 0, 15, 30, 60 y 120 d.

El contenido de carbono de la biomasa microbiana no mostró diferencias entre tratamientos los primeros 30 d. Posteriormente, en CP acusó un incremento a los 60 y 120 d, pero sólo a los 60 d, el carbono de la biomasa microbiana fue superior al registro de SP. Por otra parte, SP se mantuvo sin cambios significativos durante el desarrollo de los experimentos (Fig. 4).

Fig. 4 Variaciones del carbono (C) microbiano. Letras minúsculas iguales indican que no hay diferencias para un mismo tratamiento en diferentes tiempos. Letras mayúsculas iguales indican que no hay diferencias entre tratamientos para un mismo tiempo. Las barras corresponden a la desviación estándar (n = 5) 

Los resultados del coeficiente metabólico (qCO₂) indican que al inicio los microorganismos presentaron la mayor tasa de emisión de CO₂ por masa de C microbiano y posteriormente esta disminuye en el tiempo (Fig. 5). En los primeros 30 d no se registraron diferencias en el qCO₂ de ambos tratamientos. Entre los días 60 y 120 el qCO₂ fue menor en el tratamiento con plantas, lo que pudiera indicar una condición ambiental menos estresante, ligada a la disminución del contenido de hidrocarburos y de los compuestos más tóxicos como los aromáticos y los saturados (Figs. 1 y 2). Hecho que reduce los requerimientos energéticos y de carbono para la sobrevivencia y crecimiento de la biomasa microbiana (^{Caravaca y Roldán 2003}).

Fig. 5 Variaciones del coeficiente metabólico (qCO₂). Letras minúsculas iguales indican que no hay diferencias para un mismo tratamiento en diferentes tiempos. Letras mayúsculas iguales indican que no hay diferencias entre tratamientos para un mismo tiempo. Las barras corresponden a la desviación estándar (n = 5) 

La actividad de la enzima deshidrogenasa (ADH) mostró un pico para CP y SP a los 30 d (Fig. 6). Sin embargo sólo se encontraron diferencias significativas entre tratamientos a los 15 y 60 d, siendo mayor la ADH en CP. El incremento de la ADH los primeros 30 d se asocia al aprovechamiento del carbono del petróleo, especialmente aquellas fracciones más biodegradables como los aromáticos y los saturados. Posteriormente, a partir del día 60, con la reducción de las fracciones más biodegradables y la persistencia de las formas más recalcitrantes de los hidrocarburos, disminuyó la actividad de la enzima deshidrogenasa. ^{Mager y Hernández Valencia (2013}), señalan un comportamiento similar para la misma especie, pero en suelos contaminados con petróleo liviano.

Fig. 6 Variaciones en la actividad de la enzima deshidrogenasa. Letras minúsculas iguales indican que no hay diferencias para un mismo tratamiento en diferentes tiempos. Letras mayúsculas iguales indican que no hay diferencias entre tratamientos para un mismo tiempo. Las barras corresponden a la desviación estándar (n = 5). TPF = Trifenil formazán 

Las correlaciones lineales entre los diferentes parámetros evaluados sólo fueron significativas y de manera inversa entre el contenido de hidrocarburos y el Cmic (r² = -0.66) y de manera directa entre el contenido de hidrocarburos y el qCO₂ (r² = 0.97). Ello sugiere que: a) la biomasa microbiana incrementa a expensas de la degradación del petróleo y eventualmente de la disminución de las fracciones más tóxicas como los saturados y los aromáticos (Fig. 2) y b) con la reducción del contenido de hidrocarburos y de los compuestos más tóxicos, el ambiente del suelo es menos estresante para los microorganismos, y con ello los requerimientos de mantenimiento de la biomasa microbiana, lo que se traduce en una menor respiración por biomasa de microorganismos (Marín et al 2005).

Los resultados obtenidos muestran que M. maximus favorece la reducción del contenido de hidrocarburos en el suelo en comparación con el tratamiento sin plantas. No obstante, las diferencias son visibles a partir de los 120 d. En lapsos de tiempo menores, la planta no ejerce cambios significativos. La tasa de degradación de los hidrocarburos se puede considerar baja, tal como se esperaría para un petróleo extra pesado. Si se toma en cuenta que las fracciones de aromáticos y saturados son las más biodegradables y que el contenido inicial de estas fracciones de acuerdo con los resultados del fraccionamiento de SARA es de 32 % (Fig. 2), se podría disminuir aún más la concentración de hidrocarburos en un ensayo de mayor duración. En este estudio de 120 d la reducción del contenido de hidrocarburos y su desviación standard fue de 9.8 % ± 3.9 % para SP y 17.1 % ± 3.2 % para CP.

En cuanto al comportamiento de los parámetros microbiológicos y bioquímicos seleccionados como indicadores de la actividad microbiana, los resultados no son determinantes respecto a cuáles de ellos son más sensibles para evaluar el papel de la rizósfera y sus microorganismos asociados en el proceso de descontaminación. No obstante, algunos aspectos deben ser resaltados: a) el tratamiento con pastos mostró cambios en el tiempo para todos los indicadores bioquímicos y microbiológicos evaluados, mientras que el tratamiento sin pastos sólo para la actividad de la deshidrogenasa y el coeficiente metabólico, b) el tratamiento con pastos mostró mayor cantidad de registros en donde la actividad microbiana era mayor o similar al tratamiento sin pastos, pero nunca menor, lo cual probablemente debe estar ligado a la presencia de una rizósfera que favorece dicha actividad y c) por lo general al inicio de los ensayos no se encontraron diferencias entre tratamientos, lo que puede estar ligado al proceso de adaptación de la planta recién expuesta a la contaminación y posterior desarrollo del efecto rizosférico. Esto se hace más evidente para respiración basal, carbono microbiano y el coeficiente metabólico.

Por lo antes expuesto, es necesario realizar estudios que incorporen otros indicadores, como por ejemplo, actividades de otras enzimas ligadas a la degradación de hidrocarburos, conteo de microorganismos o biodiversidad de las comunidades microbianas, bioensayos de toxicidad, entre otros, para lograr una mejor interpretación de la información y del papel de las plantas y los microorganismos en la fitorremediación. La meta central de los procesos de remediación en un suelo debe estar orientada no solamente a disminuir la concentración del contaminante y cumplir con un criterio de “limpieza”, sino restaurar la salud del mismo, que usualmente se evalúa con variados indicadores físicos, químicos y biológicos (^{Alkorta et al. 2010}, ^{Infante y Morales 2012}).