Microorganismos

Los microorganismos fueron las cepas P15 y MR del hongo P. ostreatus, cultivadas en grano de sorgo; los cuales se adquirieron de la empresa AAC Biolab (Estado de México, México 2018). La preparación del sustrato para producir el inóculo consistió en hervir 500 g de grano entero de sorgo durante 30 min en 1 L de agua destilada que se filtró para eliminar el exceso de agua. Posteriormente, el sorgo se colocó en un matraz Erlenmeyer (Kimax^®; 500 mL), se tapó con algodón y papel de estraza, y se esterilizó a 121 ºC durante 15 min y 15 psi en autoclave (All American^® 1941X, EUA). En una campana de flujo laminar (Labconco^®, EUA), el matraz se dejó enfriar a temperatura 30 ˚C promedio, se inoculó con 50 g de micelio de una cepa de P. ostreatus y se incubó a una temperatura promedio de 30 ˚C durante 10 días sin agitación.

Sustratos

El rastrojo de maíz se obtuvo de un cultivo de maíz en Cuajinicuilapa, Guerrero (México), el cual comúnmente se quema en las parcelas como fuente de minerales para la tierra. Se colectaron tres muestras de 5 kg de totomoxtle y olote en la localidad antes mencionada. En el laboratorio, se procedió a escoger el olote y el totomoxtle para evitar contaminación por manejo, se enjuagaron con agua corriente para eliminar impurezas. Los sustratos se deshidrataron en una estufa (Felisa^® FE-293A, México) a 60 ºC por 72 h y se molieron en un molino convencional de martillos (Magro TR-3500, México) con malla de 0.5 cm de diámetro.

Fermentación sólida

En matraces Erlenmeyer (Kimax^®; 500 mL) se colocaron 50 g de cada tipo de sustrato con 80 % de humedad, se colocó un tapón de algodón y papel de estraza y se esterilizaron. En una campana de flujo laminar (Labconco^®, EUA), los matraces con sustrato estéril se inocularon con 10 % P/P de micelio P15 o MR de P. ostreatus como inóculo. A continuación, se colocó un tapón de algodón y se incubaron a 30 ˚C en promedio por cinco y diez días. Al término de cada tiempo de incubación, el contenido de cada matraz se dividió en dos para determinar, con una parte actividad enzimática y, con la otra, el análisis químico del fermento sólido (tres repeticiones).

Actividad enzimática

El fermento sólido se colocó en un mortero (Coorstek, 400 mL) y se agregó agua destilada en una relación 1:1.5, se maceró por 20 min y se filtró con doble gasa. El filtrado se centrifugó durante 25 min a 4 ºC y 9710 g en una centrífuga (Metrix^®, 69-FA15A, México) y el sobrenadante se usó como extracto enzimático (EE) para cuantificar la actividad de las celulasas y las lacasas.

La actividad de las celulasas se midió usando el método de azúcares reductores descrito por ^{Miller (1959)}. El sustrato fue carboximetilcelulosa (CMC) a 0.5 % {2.5 g de carboximetilcelulosa (Sigma-Aldrich^®, EUA) aforado a 500 mL con amortiguador de citratos 50 mM y pH 4.8 [10.507 g ácido cítrico (Meyer^®, México) aforado a 1 L con agua destilada]}. La mezcla de reacción de cada muestra contenía 0.9 mL de CMC 0.5 % y 0.1 mL de EE (se realizó por duplicado cada muestra). A continuación, se incubaron 30 minutos a 50 ºC, se agregaron 1.5 mL de solución DNS [14 g NaOH (Meyer^®, México) + 5.9 g de metabisulfito de Na (Meyer^®, México) + 29 g tartrato de Na y K (Meyer^®, México) + 1 g de ácido dinitrosalicílico (Sigma-Aldrich^®, EUA) + 5.8 mL de fenol líquido (Golden Bell Reactivos^®, México) aforado a 1 L con agua destilada] y se hirvió por 5 min, e inmediatamente se introdujeron en un recipiente de agua helada. Para cada muestra se preparó un blanco con 0.9 mL de CMC 0.5 %, se incubó 30 min a 50 ºC, se agregaron 1.5 mL de solución DNS y 0.1 mL de ECE; se hirvió por 5 min, e inmediatamente se introdujeron en un recipiente de agua helada. Las muestras y los blancos se midieron a una absorbancia de 540 nm en un espectrofotómetro UV-VIS (Jenway^® 6850, EUA). La curva estándar se preparó con una solución de glucosa 10 mM [0.18 g de dextrosa (Merk^®, México) aforada con 100 mL de amortiguador de citratos 50 mM y pH 4.8]. Una unidad de actividad de celulasa (U) se definió como la cantidad de enzimas que libera 1 µmol/min de glucosa.

La actividad de las lacasas se determinó por la generación de radicales 2,2-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico) por la oxidación de ABTS (^{Wolfenden y Wilson 1982}). La mezcla de reacción de cada muestra contenía 1.6 mL de agua destilada, 0.2 mL de EE y 0.2 mL de reactivo ABTS {0.069 mg ABTS (Sigma-Aldrich^®, EUA) aforado en 25 mL de amortiguador de citratos 50 mM y pH 5.3 [10.507 g ácido cítrico (Meyer^®, México) aforado en 1 L con agua destilada]}. La mezcla de reacción se incubó 1 min a 40 ºC. La absorbancia a 420 nm se registró cada 10 s por 2 min. Una unidad de actividad de lacasa (U) se definió como la cantidad de enzimas que produce 1 µmol/min de ABTS oxidado.

Análisis bromatológico

Los fermentados sólidos se deshidrataron a 60 ºC por 48 h para obtener la materia seca (MS); posteriormente, se molieron con una criba de 1 mm en un molino Thomas-Wiley Mill (Thomas Scientific^®, Swedesboro, NJ, EUA). Antes (Cuadro I) y después de la fermentación sólida, en los sustratos se determinó proteína cruda (PC; método 976.05), cenizas (Ce; método 942.05) y materia orgánica (MO) de acuerdo con la metodología descrita por ^{AOAC (2005)}; la fibra detergente neutro (FDN) y la fibra detergente ácido (FDA) se determinó utilizando la adaptación de ^{Van Soest et al. (1991)}, Ankom ficrofilter Technology. La hemicelulosa se calculó por la diferencia entre FDN y FDA.

Análisis estadístico

La actividad de las celulasas y las lacasas, así como el análisis químico (tres repeticiones independientes por interacción) se analizaron en un arreglo factorial 2x3x2 dentro de un diseño completamente al azar, considerando como factores a las cepas de P. ostreatus (P15 y MR), tipo de sustrato (rastrojo, olote y totomoxtle) y tiempo de fermentación sólida (5 y 10 dias). Las medias se ajustaron por mínimos cuadrados para compararlas con la prueba de Tukey (α = 0.05). El modelo estadístico fue:

dónde: Y_ijkl = Variable de respuesta; μ = Media general; A_i = Efecto del factor cepa de P. ostreatus; B_j = Efecto del factor tipo de sustrato; C_k = Efecto del factor tiempo de fermentación sólida; (AB)_ij = Efecto de la interacción entre tipo de cepa y tipo de sustrato; (AC)_ik = Efecto de la interacción entre tipo de cepa y tiempo de fermentación sólida; (BC)_jk = Efecto de la interacción entre tipo de sustrato y tiempo de fermentación sólida; (ABC)_ijk = Efecto de la interacción entre tipo de cepa, tipo de sustrato y tiempo de fermentación sólida; ε_ijkl = Error aleatorio.

Actividad enzimática

A mayor tiempo de fermentación sólida de P. ostreatus en subproductos del maíz, mejora la actividad de las celulasas debido a que el hongo tiene más tiempo para producir celulasas que degradan la pared celular de los subproductos del maíz por su contenido de FDN y FDA (Cuadro I). El cuadro II muestra la actividad enzimática y el análisis bromatológico según los factores; es decir el comportamiento por tipo de cepa, tipo de sustrato y tiempo de fermentación. La actividad de las celulasas no mostró diferencias entre tipo de cepas y tipo de sustrato (p > 0.05), con un promedio de 1.58 U/g (Cuadro II). Esto indica que la actividad de las celulasas no se vio afectada por las cepas de P. ostreatus, ni por el uso de rastrojo, olote y totomoxtle como sustrato en la fermentación sólida. La fermentación sólida a los diez días produjo 4.5 veces más celulasas que a los cinco días (p < 0.05; Cuadro II).

Los valores de las celulasas a los cinco días de fermentación sólida de este estudio son similares a los reportados por ^{Sánchez-Santillán et al. (2015a)}; mientras que a los diez días son mayores a lo publicado por ^{Membrillo et al. (2011)}, ^{Sánchez-Santillán et al. (2015b)} y ^{Soto-Sánchez et al. (2015)}. Los valores reportados son 0.6 U/g en bagazo de caña de azúcar inoculado con P. ostreatus con cinco días de fermentación sólida (^{Sánchez-Santillán et al. 2015a}); 0.225 U/g en bagazo de caña de azúcar inoculado con P. ostreatus con siete días de fermentación sólida (^{Membrillo et al. 2011}); 0.3 U/g en bagazo de caña de azúcar inoculado con P. ostreatus con 15 días de fermentación sólida (^{Sánchez-Santillán et al. 2015b}), y 1.6 U/g en paja de cebada inoculada con Pleurotus sapidus con ocho días de fermentación sólida (^{Soto-Sánchez et al. 2015}).

La actividad de las lacasas por factores mostró que P15 produjo 44.3 % más que MR; el olote y el rastrojo produjeron 79.4 % más que el totomoxtle, y en cinco días de fermentación se produce 56.2 % más que a los diez días (p < 0.05; Cuadro II). El cuadro III muestra las variables que presentaron triple interacción entre factores, es decir, aquellas que presentaron diferencias cuando interactuaron entre cepas, tipos de sustratos y tiempo de fermentación. La mejor actividad de las lacasas se presentó cuando se realizó la fermentación sólida por cinco días usando la cepa P15 y olote como sustrato (p < 0.05; Cuadro III). Cabe destacar, que ésta no presentó diferencias con la misma cepa y tiempo de fermentación usando el rastrojo como sustrato (p > 0.05; Cuadro III).

^{Membrillo et al. (2008)}, ^{Luna et al. (2013)}, ^{Méndez-Hernández et al. (2018)} y ^{Ganash et al. (2021)} publicaron valores inferiores en la cuantificación de la actividad de lacasas que la cepa P15 con cinco días de fermentación sólida en olote del presente estudio. Membrillo et al. (2008) reportaron 0.02 UI/g MS en bagazo de caña de azúcar (2.9 mm de tamaño de partícula) inoculado con P. ostreatus por ocho días; ^{Luna et al. (2013)} cuantificaron 3.46 UI/g MS en una fermentación sólida de 12 días con rastrojo de cebada y P. ostreatus; mientras, ^{Méndez-Hernández et al. (2018)} informaron una cuantificación de 1.4 y 4.1 U/g con una fermentación de cinco y diez días con rastrojo de maíz y Fomes sp; y ^{Ganash et al. (2021)} publicaron 2.1 y 2.2 U/mL en rastrojo de maíz inoculado con P. ostreatus por cinco y diez días.

^{Márquez et al. (2007)} mencionan que P. ostreatus presenta mayor actividad de lacasas (13.9 UI/g MS) que de celulasas (1.06 UI/g MS), lo que coincide con lo reportado en el presente estudio (Cuadros II y III). Asimismo, la actividad enzimática de P. ostreatus varía según las condiciones del proceso de fermentación sólida: tipo de microorganismo a usar, el tiempo de la fermentación sólida, el tipo de sustrato y su tamaño de partícula, la afinidad enzima-sustrato (^{Kumar et al. 2008}, ^{Sánchez-Santillán et al. 2015b}, ^{Zárate-Salazar et al. 2020}), la composición de la pared celular del sustrato, la naturaleza del inóculo, la temperatura (^{Park et al. 2002}, ^{Sánchez-Santillán et al. 2015a}, ^{Zárate-Salazar et al. 2020}), la estructura de la planta utilizada (olote o totomoxtle; ^{Luna et al. 2013}, ^{Zárate-Salazar et al. 2020}, ^{Ganash et al. 2021}) y las propiedades mecánicas y físicas de los sustratos (^{Ganash et al. 2021}).

Composición química

El contenido de MS no mostró diferencias (p > 0.05) entre las cepas MR y P15 de P. ostreatus, ni entre los sustratos rastrojo, olote o totomoxtle (Cuadro II); fue 57.7 g mayor que la MS inicial de los sustratos antes de iniciar la fermentación sólida. Sin embargo, la fermentación sólida a los cinco días mostró 18.1 % mayor contenido de MS que la fermentación con diez días (Cuadro II). Los cambios en el contenido de MS se asumen a la cantidad de agua que se evaporó durante el tiempo de fermentación sólida evaluado; dado el contenido de MS inicial (20 %) y la cantidad de biomasa fúngica que se sintetizó por el crecimiento de P. ostreatus

El contenido de proteína cruda (PC) no presentó diferencias entre sustratos, ni con tipo de cepa de P. ostreatus (p > 0.05). No obstante, la fermentación sólida con diez días mostró un incremento de 53.6 % respecto a la fermentación con cinco días (Cuadro II). Si comparamos el contenido de PC de los sustratos antes y después del proceso de fermentación sólida, se observa que el contenido de PC es menor después del proceso de fermentación sólida.

Esto se puede deber al hecho de que el hongo utiliza la proteína presente en el sustrato para satisfacer sus necesidades de nitrógeno para biosíntesis de proteína microbiana (^{Sánchez-Santillán et al. 2015b}); mientras, las diferencias entre los tiempos de fermentación se relacionan con el crecimiento del micelio del hongo (Olivera-De la Cruz et al. 2019). Valores inferiores de PC (Cuadro II) se reportaron en paja de trigo usada como sustrato en fermentaciones sólidas hasta por 30 días inoculadas con P. ostreatus (^{Shrivastava et al. 2011}), así como superiores en fermentaciones sólidas de cinco días en rastrojo de maíz inoculado con P. ostreatus (^{Khonkhaeng y Cherdthong 2019}).

El cuadro IV presenta las variables por tipo de sustrato a diferentes tiempos de fermentación. Cabe destacar que las cepas no mostraron interacción con el tipo de sustrato, ni con el tiempo de fermentación (p > 0.05). El olote sometido a diez días de fermentación sólida mostró el mayor contenido de fibra detergente neutro (FDN), 150.9 g más que el rastrojo fermentado por cinco días, que presentó el menor contenido de FDN (p < 0.05; Cuadro IV). El sustrato donde se inoculó la cepa MR mostró 2.7 % menos contenido de FDN que la cepa P15; el sustrato a los cinco días de fermentación sólida presentó 8.6 % menos FDN que los sustratos a los diez días; el rastrojo de maíz presentó 3.2 % menor contenido de FDN que el totomoxtle, y este 7.2 % menos que el olote (p < 0.05; Cuadro IV). Esto se explica porque las cepas MR y P15 consumieron carbohidratos estructurales como fuente de energía para su crecimiento (^{Okano et al. 2007}, ^{Sánchez-Santillán et al. 2015b}).

El rastrojo con diez días de fermentación sólida mostró el mayor contenido de FDA, 150.8 g más que el totomoxtle con cinco días de fermentación, que presentó el menor contenido de FDA (p < 0.05; Cuadro IV). La inoculación de las cepas MR y P15 de P. ostreatus no modificó el contenido de FDA de los sustratos usados en el presente estudio (p > 0.05). El sustrato aumentó 14.6 % el contenido de FDA al pasar de cinco a diez días de fermentación sólida. El contenido de FDA en el rastrojo de maíz fue 10.9 % mayor que en el olote y este mostró 10.9 % mayor contenido que el totomoxtle (p < 0.05; Cuadro II).

El contenido de hemicelulosa de los sustratos no varió cuando se usó la cepa MR o la P15 de P. ostreatus, ni por el tiempo de fermentación sólida (p > 0.05). Además, el rastrojo presentó el menor contenido de hemicelulosa (p < 0.05; Cuadro II). Esto porque la hemicelulosa está unida a la lignina y la actividad de las lacasas de P. ostreatus favoreció al hidrolizar de la hemicelulosa al hidrolizar parte de la lignina adherida (^{Machado et al. 2020}). Cabe destacar que después del proceso de fermentación sólida, tanto el rastrojo como el totomoxtle disminuyeron su contenido de FDN, FDA y hemicelulosa (Cuadros I y II). Esto se puede atribuir a la actividad enzimática del hongo sobre la pared celular de los sustratos del maíz.

Comportamientos similares entre factores respecto al contenido de FDN, FDA y hemicelulosa (Cuadros II y IV) se publicaron en paja de trigo como sustrato y P. ostreatus como inóculo en fermentaciones sólidas de hasta 30 días (^{Shrivastava et al. 2011}). Además, se reportaron valores superiores de FDN (813.5 g/kg MS), FDA (507.6 g/kg MS) y hemicelulosa (341.8 g/kg MS) (Cuadros II y IV) en fermentaciones de hasta 24 días con paja de cebada como sustrato y P. ostreatus como inóculo (^{Soto-Sánchez et al. 2015}).

La variación en los contenidos de los componentes de la pared celular (FDN, FDA y hemicelulosa) después del proceso de fermentación sólida se puede atribuir a la composición de la pared celular del rastrojo, olote y totomoxtle, así como al complejo lignina-carbohidratos estructurales. Esta disminución es una consecuencia de las enzimas producidas por las cepas MR y P15 de P. ostreatus durante su crecimiento (^{Okano et al. 2006}).

La interacción que mostró el mayor contenido de cenizas (Ce) y, por consiguiente, la menor cantidad de materia orgánica (MO) fue la fermentación sólida de 10 días usando rastrojo como sustrato y la cepa MR como inóculo (p < 0.05); con un valor superior en Ce e inferior en MO en comparación con el sustrato antes de iniciar la fermentación sólida. Esto indica que la cepa MR usó los carbohidratos y PC del sustrato para su metabolismo, lo que se reflejó en una disminución de la MO (^{Akinfemi et al. 2008}). ^{Luna et al. (2013)} y ^{Soto-Sánchez et al. (2015)} publicaron valores inferiores de MO en fermentaciones sólidas de 24 días con paja de cebada como sustrato y P. ostreatus como inóculo (^{Soto-Sánchez et al., 2015}), así como en fermentaciones de 8, 16 y 30 d con paja de cebada como sustrato y P. ostreatus como inóculo (Luna et al. 2013). ^{Khonkhaeng y Cherdthong (2019)} reportaron mayor contenido de MO en fermentaciones sólidas de cinco días en rastrojo de maíz inoculado con P. ostreatus.