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ANTECEDENTES
En la bibliografía clásica se establece que alrededor del 40% de las causas de infertilidad son atribuibles al factor masculino.1,2 A pesar de esto, el análisis convencional del semen permanece como la única prueba de rutina para diagnosticar problemas en el varón.
La integridad genética del gameto masculino es decisiva para un embarazo sano y exitoso.3 La bibliografía sugiere que la alta fragmentación del ADN espermático es un marcador de calidad y posible predictor de fertilidad.4,5
En su edición más reciente, el manual de la Organización Mundial de la Salud para la evaluación del factor masculino (quinta edición), ajusta los parámetros de tal modo que se tienen menos varones clasificados como infértiles.6 Esto representa un problema debido a que el análisis convencional del semen puede mostrar valores normales cuando hay altos niveles de fragmentación del ADN espermático7,8,9 y que, como tal, tiene un valor predictivo bajo para la evaluación en fertilidad y función espermática.10
Aunque un espermatozoide con daño en el ADN puede fertilizar un ovocito,11,12 una pregunta ha despertado gran interés: ¿qué pasa con los ovocitos que no pueden reparar al ADN espermático? Nuestros conocimientos aún son limitados y gran parte de las observaciones se basan en suposiciones acerca del complejo mecanismo de la fertilización, implantación, desarrollo y nacimiento de un niño sano.
El papel de la fragmentación del ADN espermático es, por lo tanto, motivo de controversia; por esto, el propósito de esta revisión es: definir dónde nos encontramos para poder partir hacia la utilidad de las pruebas de fragmentación del ADN espermático.
METODOLOGÍA
La búsqueda bibliográfica se efectuó en las bases de datos: Medline, Pubmed, Pubmed Central y Google Scholar, con las palabras clave: DNA fragmentation, sperm DNA fragmentation, human sperm fragmentation y sperm DNA fragmentation tests. No hubo restricción por fecha debido a la importancia de conocer el desarrollo y la evolución de los conceptos y las pruebas que se han utilizado en la clínica. Se realizan filtros de la búsqueda con base en ensayos clínicos controlados, revisiones y metanálisis. Criterios de selección: artículos escritos en español o inglés; consistencia y metodología adecuadas en el caso de ensayos clínicos y en los metanálisis; y aplicación de los estudios o pruebas en humanos. Se dio preferencia a los estudios que aportaron información acerca de la repercusión de las técnicas actuales para evaluar la fragmentación del ADN espermático humano, su utilidad y aplicaciones clínicas.
Se incluyó, además, una breve revisión de la definición del concepto "fragmentación del ADN" y de las características que hacen al espermatozoide único y diferente de las demás células. Por último se hace una serie de recomendaciones de práctica clínica con base en lo que nuestro grupo considera el mejor abordaje en este tema.
RESULTADOS
Las palabras clave más generales, como: fragmentación del ADN y fragmentación del ADN espermático, resultaron en más de 20,000 y 1,600 artículos, respectivamente. Se llevó a cabo una exhaustiva selección con base en los criterios señalados y, sobre todo, la aplicación en humanos. La muestra se redujo a 409 artículos, de los que se seleccionaron 143 con adecuada metodología o relevancia clínica. Se encontraron 16 metanálisis y de éstos se seleccionaron 5 por su metodología y claridad en los resultados.
Fragmentación del ADN
La fragmentación del ADN se ha descrito desde trabajos como el de Hans Ris y Mirsky (1949), quienes mencionan que la estructura de los cromosomas cambia por eventos espontáneos o en condiciones experimentales (rayos X, etc.) que causan roturas (fragmentación) de los mismos.13
Este grupo, aísla cromosomas del núcleo en reposo de tejidos de mamíferos describiéndolos como cuerpos de tamaño y forma característica, visiblemente dobles con regiones en espiral y otras sin ellas.13 Su trabajo consistía principalmente en explicar el estado físico o visible de los cromosomas, ya que en esa época el concepto de que los cromosomas pasaban por diferentes cambios dependiendo del ciclo celular estaba sin definir. A través de fotografías ultravioleta de células intactas y teñidas con tinción de Feulgen se observó una distribución par del ADN en el núcleo. Dependiendo del estado del ADN altamente polimerizado, cada cromosoma existe ya sea en un estado extendido o condensado. Durante la mitosis, los cromosomas se enrollan y toma lugar una condensación parcial del ADN, por lo tanto, son visibles en las células en división.13 Concluyen que la capacidad de condensación de los cromosomas depende de su contenido en ADN, ya que si éste ha sido removido, el cromosoma pierde su propiedad reversible de extensión y condensación.13
El concepto estricto de Fragmentación del ADN fue introducido en 1970, cuando Williamson14 aisló ADN de hepatocitos de embrión de ratón. El ADN aislado presentaba diferentes grados de absorción para una marca determinada y esta diferencia es común entre el ADN del citoplasma y el ADN nuclear. Por lo tanto, formuló la hipótesis de que los fragmentos de ADN citoplasmáticos correspondían a una degradación específica de ADN nuclear asociada a muerte celular o apoptosis.
La apoptosis es un mecanismo de muerte celular involucrado en inflamación, diferenciación celular y proliferación.15 Se caracteriza por cambios morfológicos y bioquímicos que incluyen ensanchamiento de la membrana plasmática, exposición de fosfatidilserina, condensación nuclear y fragmentación del ADN.16
Durante la apoptosis, las roturas del ADN ocurren en dos etapas: la primera es el clivaje en los dominios de asa de la cromatina para generar fragmentos de ADN de masa molecular relativamente alta; la segunda etapa es el clivaje de esas partes "sueltas" del ADN internucleosomal en fragmentos de ADN de masa molecular pequeña.17
Las caspasas son mediadores clave de la fragmentación del ADN. Activan casi todas las vías de apoptosis a través de un amplio rango de proteínas nucleares y citoplasmáticas.18 No obstante, la ausencia o el inactivar las caspasas no previene la fragmentación de ADN.19,20 Se han descrito diversas nucleasas como responsables en la degradación del ADN durante la apoptosis, dos de las principales son la endonucleasa G (EndoG) y el factor de fragmentación del ADN (DFF).15
Cada nucleasa tiene una localización distintiva, se regulan por diferentes vías y generan fragmentación del ADN por distintos caminos. Por ejemplo la translocación de la EndoG de la mitocondria al núcleo conduce a fragmentación del ADN,21 mientras que la activación nuclear del DFF lleva a una fragmentación del ADN oligonucleosomal característica.22
Para el proceso de activación de la muerte celular por las caspasas, la fosforilación reversible de las proteínas desarrolla un papel importante. Diversas cinasas y fosfatasas participan en el control de supervivencia o muerte celular, por lo que sus inhibidores son utilizados comúnmente como inductores de apoptosis o inhibidores de ésta. Determinar la relación que existe entre las proteínas y la fosforilación ayudaría a comprender cómo se regula la apoptosis.
Fragmentación del ADN espermático
El conjunto de ADN, histonas y proteínas no histónicas, forma las estructuras de alto orden llamadas cromatina.23 Su unidad básica es el nucleosoma, que consiste en alrededor de 146 pares de bases de ADN envuelto alrededor de un octámero de histona.23,24 La estructura de la cromatina se modifica por distintos mecanismos y es un factor regulatorio para diversos procesos biológicos que incluyen la replicación del ADN, su reparación, división celular y transcripción.25,26,27
La cromatina del espermatozoide difiere de la correspondiente a las células somáticas en sus constituyentes y arreglo.28 Durante la espermiogénesis las protaminas (casi la mitad de tamaño que una histona) reemplazan la mayoría de las histonas y la cromatina cambia a una estructura "superenrollada" denominada toroides.29 Una vez que el espermatozoide pasa a través del epidídimo las protaminas se unen por enlaces disulfido reduciendo la cromatina a una sexta parte del volumen de una célula somática.30 Esta densa compactación da protección contra el daño exógeno del ADN espermático.11,31 El "alto" condensamiento y su naturaleza insoluble, juegan un papel protector durante el paso de los espermatozoides a través de los conductos reproductivos masculino y femenino.32,33 A pesar de esta protección los niveles basales de daño sobre el ADN espermático son relativamente altos en el varón cuando se comparan con otras especies34 y además, los espermatozoides de varones infértiles son más susceptibles al daño con el tiempo después de la eyaculación.35
La fragmentación del ADN espermático se define como roturas del ADN espermático de cadena sencilla o doble36 y se dice que es una de las causas de subfertilidad en el varón.
El ADN espermático se vuelve susceptible al daño si el empaquetamiento de la cromatina no se completa durante la espermatogénesis cuando ocurre el reemplazo por protamina.28 Este reemplazo, en el proceso de remodelación de la cromatina, se facilita por nudos temporales ligados a actividad de topoisomerasa,37 si los nudos no se corrigen, evolucionan a ADN fragmentado en espermatozoides maduros.28 También puede haber daño inducido por radicales libres de oxígeno presentes durante la espermatogénesis.34
El daño de cadena doble del ADN está relacionado con apoptosis, hidrólisis por caspasas y endonucleasas, y por radicales libres de oxígeno, haciéndolo más difícil de reparar que el de cadena sencilla.34
Se cree que las anomalías en los paquetes de cromatina del espermatozoide humano se deben a defectos en los mecanismos de condensación nuclear como la falta de depósito de protamina durante la espermatogénesis.38,39 Estas anomalías pueden asociarse con una incrementada inestabilidad del ADN y la sensibilidad a la desnaturalización. Griveau y colaboradores,40 también observaron que los hombres con astenozoospermia presentan un alto porcentaje de espermatozoides con núcleos anormales y una lenta e incompleta descondensación de la cromatina.
El daño al ADN del espermatozoide puede afectar tanto al ADN mitocondrial como al nuclear y básicamente puede ser inducido por 6 mecanismos principales, definidos ampliamente por Sakkas y Álvarez.34 Estos pueden ocurrir durante la producción o el transporte de los espermatozoides e incluyen:
Apoptosis durante la espermatogénesis. Durante el proceso de espermatogénesis, la célula germinal muestra un mecanismo de tamizaje controlado por las células de Sertoli, que inducen la apoptosis en el 50 a 60% de todas las células que alcanzan la meiosis I. Estas células son seleccionadas a través de marcadores apoptósicos del tipo Fas y son fagocitadas y eliminadas por la célula de Sertoli a que estén asociadas.41,42,43 Este mecanismo no siempre funciona eficientemente y un porcentaje variable de estas células germinales defectuosas entra al proceso de espermiogénesis apareciendo posteriormente en el eyaculado. Un estudio de Burrello y su grupo44 sugiere que hay una disociación entre la calidad del genoma de la célula germinal y el espermatozoide resultante. Esto significa que las células germinales que tengan el núcleo dañado por la apoptosis, pueden formar espermatozoides morfológicamente normales.
Roturas de la cadena del ADN durante el remodelado de la cromatina en la espermiogénesis. Dos autores, McPherson y Longo,45,46 propusieron que los nudos en el ADN de espermatozoides del eyaculado pueden ser indicio de una incompleta maduración durante la espermiogénesis. Afirman que el empaquetamiento de la cromatina puede requerir actividad endógena de nucleasa para crear y ligar los nudos que facilitan la protaminación. Estos nudos proveen de un "descanso" al estrés de la torsión de la cadena durante el desplazamiento de histonas por protaminas.47 Alteraciones que en el control de este proceso, culminan con anomalías del empaquetamiento de la cromatina o nudos de ADN no reparados.
Fragmentación post-testicular del ADN inducida por radicales de oxígeno durante el transporte a través de los túbulos seminíferos y el epidídimo. El espermatozoide inmaduro produce gran cantidad de radicales libres de oxígeno (ROS) que pueden dañar el ADN del esperma maduro. Ambos espermatozoides conviven durante su transporte de los túbulos seminíferos hacia la cauda del epidídimo.48 A pesar de que la vida media de los ROS es de nanosegundos a microsegundos, el alto empaquetamiento para el almacenaje en el epidídimo facilita el daño por ROS. Este daño puede ser directo o a través de la activación de caspasas y endonucleasas. En general, el grado de fragmentación del ADN espermático es mayor en el eyaculado que en el esperma testicular49,50 y en el cuerpo y cauda del epidídimo. La inducción de fragmentación del ADN espermático del epidídimo puede estar relacionada con la calidad del genoma. Esto sería un mecanismo más por el que la célula de Sertoli elimina espermatozoides dañados genómicamente.51
Fragmentación del ADN por caspasas y endonucleasas. La activación de las caspasas y endonucleasas espermáticas por los ROS y otros factores fisicoquímicos induce fragmentación del ADN espermático. Estudios en ratones muestran cómo la exposición a temperaturas superiores a 40°C induce fragmentación del ADN espermático, incluso dentro de la primera hora de exposición al calor.52,53 Puesto que el núcleo de los espermatozoides del ratón está empaquetado de manera más homogénea que en el hombre, es factible pensar que éste es más susceptible al calor debido a las bajas concentraciones de protamina en el núcleo y la mayor heterogeneidad del empaquetamiento nuclear.54
Daño al ADN por radioterapia y quimioterapia. El efecto citotóxico de la quimioterapia o radioterapia sobre el epitelio espermatogénico se cree que es el causante de la reducción de esperma y la consiguiente infertilidad masculina.55 Los estudios específicos sobre este tema son limitados. O'Flaherty y su grupo56 observaron que la integridad y compactación espermáticas se veían afectadas en pacientes con cáncer testicular y linfoma de Hodgkin aún antes de la quimioterapia.
Daño inducido por tóxicos ambientales. Estudios previos muestran la evidencia de una asociación entre la exposición a las altas concentraciones de contaminantes aéreos y el incremento del daño al ADN espermático. En un trabajo de Rubes y sus coautores57 se plantea la hipótesis de que los hombres que son homocigotos para la glutatión-S-transferasa M1 tienen menor capacidad de eliminar metabolitos reactivos de hidrocarbonos aromáticos policíclicos carcinogénicos encontrados en el aire. Por lo tanto, estos varones serían más susceptibles a los efectos dañinos sobre la cromatina espermática.
Conviene señalar que los procesos de conservación de espermatozoides (criopreservación y descongelación) inducen fragmentación del ADN espermático, independientemente de las características de la muestra en fresco.58 Ha sido afirmado que este efecto se debe, fundamentalmente, a estrés oxidativo.59 No obstante, otros autores no han confirmado este hecho de la criopreservación.60
Reparación del ADN espermático
Hay tres caminos diferentes para las células que experimentan daño en el ADN28
Activar la vía apoptósica, lo que conduce a muerte celular.
Tolerar la lesión, que puede llevar a mutaciones para la siguiente generación.
Reparar la lesión, mediante la activación de mecanismos de reparación en las células germinales de mamíferos, como por ejemplo: a) reparación por escisión de nucleótidos (NER), reparación por escisión de bases (BER), reparación no idéntica (MMR), reparación post-replicación (PRR) y reparación de rotura de doble cadena de ADN (DSBR).
La espermatogénesis consiste en tres fases resumidas: 1) la espermatogonia pasa por una serie de divisiones mitóticas y se diferencia en espermatocitos primarios; 2) los espermatocitos llevan a cabo la recombinación meiótica dando origen a espermátides haploides; y 3) la espermiogénesis involucra el rearreglo de la estructura del citoesqueleto y transformación de las espermátides redondas a espermatozoides maduros. Por lo tanto, la maduración de las células germinales comprende una reorganización genómica y un proceso extraordinario de remodelaje para generar gametos haploides.61
Durante la espermiogénesis, la transición de histona a protamina en la cromatina espermática produce roturas de las cadenas de ADN.47,62 Estas roturas fisiológicas permiten cambios topológicos asociados con la relajación del ADN durante el intercambio de nucleoproteínas y se le atribuye a la actividad de topoisomerasa beta II (TOP2B).63 Estos pasos coinciden con la hiperacetilación de histonas, lo que puede representar una condición necesaria para las roturas de cadena y permitir la remoción del super-enrollamiento del ADN. Durante el remodelaje de la cromatina en las espermátides, las actividades de condensación de ADN originadas por las protaminas y proteínas, optimizan el proceso de reparación enfatizando el enlace entre una condensación de ADN espermático alterada y la fragmentación del ADN.28
Las roturas de doble cadena de ADN son una lesión que lleva a fragmentación de cromosomas, pérdida de dominios, translocaciones u otros re-arreglos del genoma.64 Algunos de los mecanismos más importantes para reparar este tipo de daño en las células de mamíferos son las recombinaciones no homólogas y homólogas de uniones terminales.65 La diferencia entre ambas sería que las reparaciones homólogas utilizan una plantilla no dañada que asegura una reparación exacta, la no homóloga no provee de esta ventaja. Es difícil determinar cuál es la vía más utilizada ya que varía mucho entre los diferentes tipos celulares.28
Las células espermatogénicas difieren en los mecanismos de reparación de roturas de doble cadena. Una de las vías requiere de la actividad sináptica de PARP-1 y la actividad ligando del complejo ligasa XRCC1-ADN III, que son proteínas involucradas en la escisión de bases y reparación de cadena sencilla.66 Las espermátides redondas utilizan esta vía alterna para reparar los daños inducidos por radiación.67
Hay evidencia que la estructura de la cromatina ejerce una gran influencia en los procesos de reparación del ADN.68,69,70 La modulación de la estructura de la cromatina es una importante condición para el reclutamiento y la función de las proteínas de reparación de ADN.28 El primer evento asociado a la rotura de doble cadena fue la fosforilación de H2AX, y se cree que es una plataforma para el reclutamiento o la retención de las moléculas de reparación y señalización de ADN en los sitios dañados.28
Las espermatogonias carecen de una heterocromatina compactada y la detección y señalización del daño al ADN es mediado en ausencia de los complejos H2AX/MDC1. Los daños inducidos por radiación son reparados por mecanismos de proteincinasas independientes.28
En resumen, la reparación del ADN sucede en el espermatozoide en desarrollo, pero una vez que terminan la transcripción y traducción post-espermiogénesis, no existen mecanismos que corrijan el daño que ocurre en su tránsito y almacenamiento en el epidídimo o post-eyaculación.28 No obstante, los ovocitos y embriones tempranos han demostrado su capacidad de reparar algunos tipos de daño del ADN espermático lo que da por resultado que el efecto biológico de la estructura anormal de la cromatina espermática depende del alcance del daño y la capacidad del ovocito de repararlo.28
Fragmentación del ADN: cuantificación
En las últimas dos décadas se han diseñado pruebas para medir la fragmentación del ADN espermático y predecir el efecto que ocasiona en los resultados de fertilidad ya sea tras concepción natural o por reproducción asistida. Las pruebas más utilizadas incluyen:
TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUDP nick-end labelling assay).
En 1992, Gavrieli y su grupo71 describieron una técnica para visualizar muerte celular programada (MCP) in situ, preservando así la arquitectura del tejido. Ellos asocian la MCP con fragmentación del ADN, necesaria para el desarrollo biológico y el mantenimiento de tejidos en renovación.71
El método se basa en la unión específica de la transferasa terminal deoxinucleotidilo (TdT) a las terminaciones 3'OH del ADN, produciendo la síntesis de un polímero de polideoxinucleotido.71 El TdT se utiliza para incorporar deoxiuridina biotinilada en los sitios de roturas del ADN para luego amplificar esta señal y ser visualizada por microscopio de luz. En su trabajo utilizaron diferentes tejidos demostrando la fragmentación del ADN en sitios como epitelio de intestino delgado timo, y ovario.71 Es interesante mencionar que también buscaron MCP en tejido endometrial durante la menstruación sin éxito alguno, confirmando la hipótesis de la descamación del endometrio por un mecanismo de isquemia tisular.71
Esta técnica ha mostrado un alto valor predictivo para fertilidad masculina en concepción natural, con 96,5% de sensibilidad y 89,4% de especificidad.72,73
COMET (single cell gel electrophoresis assay).
Ostling y Johanson describieron en 1984 un método para medir el daño del ADN en las células basado en la técnica de microelectroforesis.74 Hughes y su grupo75 (1996) adaptan esta técnica para su uso en espermatozoides. Las células espermáticas son colocadas en una capa delgada de agarosa y lisadas con detergente en una solución con alta concentración de sal; este proceso elimina las protaminas e histonas y permite al núcleo formar estructuras que contienen asas "súper-enrolladas" de ADN; las condiciones alcalinas del pH provocan un desdoblamiento de las cadenas doble de ADN y la electroforesis permite la migración de las cadenas rotas al ánodo, formando un cola de cometa al ser observado bajo microscopio de fluorescencia, de ahí el nombre de la prueba.76 La intensidad de la fluorescencia es dependiente de la cantidad de ADN en la cabeza y la cola, lo que refleja el nivel del daño al ADN que presenta la célula.76
Entre sus ventajas se encuentra que solo se necesitan 5000 espermatozoides de una muestra para el análisis, por lo que es útil en pacientes con oligoespermia.77 Otras características son que permite detectar grados de daño del ADN en un espermatozoide determinado y que mide roturas de cadena sencilla y doble, así como bases alteradas.77
Simon y sus colaboradores78 compararon la tasa de nacido vivo posterior a RA dividiendo los grupos en base a la fragmentación del ADN. Se demostró de manera significativa que la menor fragmentación del ADN espermático resultaba en mayor tasa de nacido vivo.78
SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay).
Se utiliza para valorar la calidad seminal en humanos desde principios de los 90.79 Esta prueba mide indirectamente la susceptibilidad del ADN espermático a la desnaturalización por ácido. Inicialmente se trata la muestra de semen con un pH de 1.2 para abrir las cadenas de ADN en los sitios de rotura del mismo, posteriormente, se marcan los espermatozoides con naranja de acridina, un tinte que identifica las cadenas rotas de ADN como rojo fluorescente y las cadenas no rotas como verde fluorescente.80
A partir de los resultados obtenidos mediante la técnica SCSA se desarrolló el índice de fragmentación81 que describe la proporción de espermatozoides rojo fluorescente que contienen las roturas de ADN en relación con los espermatozoides teñidos en verde que no tienen fragmentación. Se puede afirmar que la técnica SCSA es la más estudiada desde el punto de vista clínico,34 aunque las tres pruebas son referidas constantemente en trabajos científicos6,82 para detectar fragmentación del ADN.12,83,84,85,86,87,88,89
SCDt (Sperm Chromatin Dispersion Test).
Al llevar a cabo la desnaturalización ácida y remoción de proteínas nucleares en espermatozoides humanos y una posterior tinción fluorescente, se observan unos halos característicos de las cadenas de ADN sanas que pueden ser observados bajo microscopía de fluorescencia o con microscopio de campo claro previa tinción con Diff-Quik. Si existe fragmentación o daño en estas cadenas, no se forman los halos o su presencia es mínima. Así es como Fernández y su grupo (2003)90 introdujeron la prueba de dispersión de cromatina en el espermatozoide (SCD). Su estudio incluyó 30 pacientes (20 de ellos con infertilidad y 10 donantes de semen) y utilizaron como control, la detección de roturas de ADN por FISH.
En realidad, la prueba SCDt mide la ausencia de daño, no la cantidad de ADN que lo presenta. Es una técnica sencilla, rápida y altamente reproducible. Se comercializa en forma de kit y por lo tanto no requiere de una instrumentación compleja y es fácilmente evaluada por técnicos de laboratorio.90 La mayor limitación es que la tinción fluorescente demuestra ser más sensible que la Diff-Quik, obligando a tener en un laboratorio, microscopía de fluorescencia para una mejor discriminación.91
Halosperm®
Con el propósito de simplificar, reducir costes y disminuir el tiempo de trabajo en el laboratorio, se desarrolló un kit basado en la prueba SCDt, llamado Halosperm®, que ha demostrado una buena correlación para la valoración de la fragmentación del ADN espermático.91
Resumiendo, el Halosperm® consiste en tomar una alícuota de semen y diluirla a 10 millones/mL en PBS (Phosphate-buffered saline). El equipo incluye tubos eppendorf con alícuotas de gel de agarosa y se colocan en baño maría entre 90 a 100°C durante 5 minutos hasta fusionarlo con la agarosa, luego se dejan en baño maría a 37°C. Después de 5 minutos de incubación, 60 mL de la muestra de semen diluida se añaden al los tubos eppendorf y se combinan con la agarosa fusionada. Del compuesto semen-agarosa, se toman 20μL en laminillas pre-bañadas con agarosa y se cubren con cubreobjetos de 22 por 22 mm. Las laminillas se colocan en una placa de frío dentro de un frigorífico a 4°C durante 5 minutos para permitir que la agarosa produzca un microgel con los espermatozoides en su interior. Los cubreobjetos se retiran y las laminillas se introducen horizontalmente en una solución ácida y se incuban durante 25 minutos. Después de lavar por 5 minutos con abundante agua destilada, las laminillas son deshidratadas en concentraciones crecientes de etanol por dos minutos y después se dejan secar al aire.91
Las laminillas se pueden almacenar a temperatura ambiente por varios meses en una caja cerrada en la oscuridad. Se pueden teñir para microscopía de fluorescencia utilizando DAPI (Roche Diagnostics) en Vectashield (Vector Laboratories), para microscopía de campo brillante o incubarse con una sonda de genoma para DBD-FISH. Para la microscopía de campo brillante, las laminillas se cubren horizontalmente con una mezcla de solución de tinción de Wright (Merck) y PBS (Merck) por 5-10 minutos con flujo de aire continuo. Las laminillas son lavadas en agua de grifo y se dejan secar.91
En el trabajo realizado por Fernández y sus colegas (2005)91 donde introducen el equipo Halosperm®, compararon su uso contra el test que se consideraba el patrón de referencia: SCSA. Enumeran las ventajas del equipo en las diferentes etapas del procesamiento de la muestra:
Mejorías técnicas. El protocolo original de la prueba SCD era inadecuado para la microscopía de campo brillante, sin embargo, el equipo Halosperm se mostró menos agresivo, con una mejor conservación de la cromatina y mantuvo una densidad más alta del material, por lo que los halos podían teñirse con mayor precisión y ser evaluados utilizando la microscopía de campo brillante con tinción de Wright. Las colas de los espermatozoides permanecen intactas, esto hace que la diferenciación contra otros tipos celulares se realice con mayor facilidad.91
Variaciones en el puntaje. Para determinar la variabilidad interobservador en el puntaje de espermatozoides con ADN fragmentado, se distribuyó una alícuota de muestra de semen congelada a tres laboratorios diferentes y procesada utilizando el kit Halosperm. Cuatro técnicos analizaron 500 espermatozoides tres veces al día en dos días distintos. La prueba de x2 no detectó diferencias significativas (p > 0.05) en los resultados. La variabilidad intraobservador se estimó a partir de los seis puntajes para cada técnico y estuvo en el rango de 6 a 12%.91
Comparación con SCSA. La comparación se hizo por medio de 45 muestras de semen de pacientes que acudían al Centro de Medicina Reproductiva de la Universidad de Minnesota y a los cuales se les realiza simultáneamente ambos estudios. Se observa una concordancia entre las dos técnicas alta (Coeficiente de correlación intraclase R:0.85), obtenido por análisis de Altman.91
Detección de daño al ADN inducido por radicales. Para demostrar la sensibilidad del nuevo test (Halosperm), se tomaron alícuotas de tres diferentes pacientes y se expusieron a concentraciones crecientes de SNP por 1 hora para inducir daño al ADN. Los pacientes 1 y 2, que tenían una baja fragmentación del ADN, mostraron un incremento similar en cuanto a la fragmentación al incrementar las dosis de SNP. El sujeto 3 tenía una fragmentación previa del 52% y posterior al tratamiento se indujo fragmentación en prácticamente la totalidad de la población espermática.91
Aplicación clínica a muestras de semen. Se comparan tres grupos: i) varones con fertilidad probada (n=9); ii) varones normozoospérmicos (n = 46) y iii) varones con oligoastenoterazoospermia (n = 23). El porcentaje de espermatozoides con ADN fragmentado en el grupo fértil fue de 5.2 a 23% (media 16.3 ±6). Este valor fue significativamente más alto (p = 0.008) en pacientes normozoospérmicos (rango de 8.6 a 51.8 con media de 27.3 ±11.7) y aún se observó mayor significancia (p < 0.000001) en el grupo de oligoastenoterazoospermia (rango de 23.2 a 85.8 con media de 47.3 ±17.3).91
Las mayores ventajas del equipo de Halosperm® son la poca variabilidad intraindividual e interindividual, que reflejan la facilidad y reproducibilidad de la prueba.91
Enciso y su equipo92 analizaron la capacidad del kit de Halosperm® para evaluar diferentes patrones de daño de ADN nuclear dentro de cada espermatozoide. En una muestra de 194 pacientes (18 con varicocele, 51 normoespérmicos, 103 con alteraciones en el análisis seminal y 22 fértiles), no encuentran diferencias en el porcentaje de fragmentación ADN espermático entre tres de los diferentes grupos, sin embargo en los pacientes con varicocele se observó el mayor daño al ADN nuclear.92
El uso del Halosperm® ha tenido buenos resultados según lo afirma Fernández y cols., además, su equipo también a descrito y recomiendan su uso combinado con Hibridación Fluorescente In Situ (FISH) para detectar aneuploidías en los mismos espermatozoides tratados con el kit, de este modo se pudiera estudiar una posible correlación entre la fragmentación del ADN y anomalías cromosómicas.93
Pregl Breznik y sus colegas94 compararon diferentes pruebas de función espermática: ensayo de unión a hialuronidasa, Halosperm® e hiperactividad. El estudio incluyó 133 parejas que se sometieron a tratamientos de FIV-ICSI y cuyas mujeres no presentaban endometriosis, ovarios poliquísticos o síndrome de ovario poliquístico. Entre los criterios de inclusión estaba el diagnóstico de factor masculino leve (concentración de espermatozoides en el eyaculado por encima de 5 x 106/mL pero menor a 15 x 106/ mL, y porcentaje de motilidad entre 25 y 40%), parejas con varias inseminaciones intrauterinas fallidas y parejas con infertilidad idiopática. Solo se incluyen parejas donde se logran obtener al menos 6 ovocitos tras la aspiración folicular. Se obtienen un total de 1760 ovocitos de los cuales 883 se utilizan en FIV y 878 para ICSI. Las parejas se dividieron en dos grupos según su tasa de fertilización posterior a FIV: Grupo 1, tasa de fertilización menor de 50%; y Grupo 2, tasa de fertilización mayor de 50%. Hubo diferencia estadísticamente significativa entre ambos grupos en términos de porcentajes de espermatozoides con la capacidad de unirse a la hialuronidasa (p=0.019) y el porcentaje de fragmentación del ADN (p = 0.004). Estos resultados se analizaron mediante curvas de ROC dando significancia estadística (punto de corte del 6.45%, con sensibilidad de 88.5% y especificidad de 44.8%; AUCROC 0.664, IC 0.538-0.790; p=0.007). Se observó una correlación negativa de las tasas de fertilización y calidad embrionaria con la fragmentación del ADN espermático. Concluyeron que las tres pruebas evaluadas son útiles para predecir la tasa de fertilización tras FIV convencional, que son métodos que pueden realizarse en un tiempo menor a dos horas y que deberían sumarse al análisis seminal de rutina para ayudar a tomar la decisión de utilizar FIV o ICSI. Destacan que el Halosperm® es útil para predecir los resultados del desarrollo embrionario.
Fragmentación de ADN y embarazo
Las consecuencias del daño del ADN en la fecundación y embarazo las han analizado varios autores. Son clásicas las observaciones de que en muestras de semen que presentan parámetros alterados en el espermiograma y bajas tasas de fecundación y división en fecundación in vitro se observan proporciones aumentadas de espermatozoides con fragmentación de ADN.95,96
Henkel y sus coautores97 evaluaron la fragmentación del ADN espermático y apoptosis utilizando las técnicas de TUNEL, unión a anexina V, tinción de naranja acridina y expresión de Fas, en 249 pacientes seleccionados aleatoriamente. Observaron diferencia significativa entre los espermatozoides negativos o positivos a TUNEL en tasa de embarazo (34.65% vs 19.05%; p = 0.0344). Establecen que la probabilidad de una mujer de lograr embarazo es casi el doble si el porcentaje de espermatozoides positivos a TUNEL es bajo (<36.5%) y el porcentaje de cromatina espermática intacta es alto (>12%). Concluyeron que los procesos apoptósicos en el espermatozoide no juegan un papel en la fecundación pero resultan deletéreos para el embarazo como consecuencia de la activación del genoma paterno y que la fragmentación del ADN espermático debida a factores externos es más importante que la apoptosis.97
Tesarik y su grupo (2004)98 compararon un grupo de 18 parejas con tres procedimientos de RA fallidos y ovocitos donados contra un grupo control de 18 parejas escogidas al azar en su primer intento de reproducción asistida y que compartían la misma donante de óvulos. Los resultados los presentan en dos categorías, efecto paterno temprano y efecto paterno tardío. En el primero, se observa una tasa de fecundación mayor de 50% pero con menos de 25% de cigotos de buena calidad para el grupo experimental; mientras que en el grupo control, prevalecen zigotos de buena morfología. Al comparar los parámetros seminales básicos, no hubo diferencia entre grupos y las tasas de fragmentación fueron muy similares, sin encontrar diferencia estadística. En la categoría de efecto paterno tardío, ambos grupos resultaron similares a excepción de encontrar una mayor fragmentación de ADN en el grupo experimental. En ambas categorías, la tasa de embarazo es significativamente mayor a favor de los grupos control (p<0.001). Concluyen que la fragmentación del ADN espermático debe ser evaluada en casos de fallo de ICSI sin alteraciones aparentes en la morfología embrionaria y, si existen alteraciones en la morfología de los embriones, debe sospecharse un factor paterno aún en ausencia de niveles anormales de fragmentación espermática.98
La fragmentación de ADN se ha relacionado con el déficit de protamina en el espermatozoide (mayor fragmentación en los espermatozoides deficitarios) por Nasr-Esfahani y colaboradores apoyan la idea de que el daño del ADN no altera la fecundación pero sí el potencial del zigoto para alcanzar el estadio de blastocisto.99 Para llegar a estas conclusiones, valoraron 28 muestras de semen de parejas referidas para ICSI. La fragmentación del ADN espermático se evaluó por COMET y la deficiencia de protamina por tinción de CMA3. Observaron una correlación significativa entre la deficiencia de protamina y la tasa de fertilización post-ICSI (p = 0.002). Sugieren que aunque la selección de espermatozoides es aleatoria en términos de daño al ADN, existe un mecanismo de control que opera después del procedimiento para asegurar que solamente aquellos cigotos con un genoma relativamente intacto continúe su desarrollo.99
En una revisión, Aitken y Baker (2006, Australia) resumieron de la siguiente manera los problemas reproductivos asociados a la fragmentación de ADN espermático. El espermatozoide es muy sensible al estrés oxidativo que induce daños en su membrana plasmática y fragmentación del ADN tanto a nivel del núcleo como a nivel mitocondrial. Las alteraciones de la membrana pueden anular su capacidad fecundante pero, en ocasiones, la fecundación puede producirse y, si existen daños en el ADN que no son reparados, pueden producirse mutaciones asociadas a pérdidas gestacionales y a distintas patologías de la descendencia, incluido el cáncer infantil.100
Fragmentación del ADN y correlación con parámetros seminales.
El análisis seminal continúa siendo el paso inicial en la valoración del varón estéril.101,102,103 El manual más reciente publicado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) en el 2010 para el examen y procesamiento del semen humano, constituye una versión muy completa que provee descripciones detalladas de los métodos y sus limitaciones.104 Sin embargo, sin restarle importancia a las guías de la OMS para la estandarización y evaluación del semen, la interpretación diagnóstica del análisis seminal sigue estando sujeta a investigación.101
La información obtenida por los parámetros seminales convencionales, refleja hasta cierta medida, la calidad del proceso espermatogénico que a su vez determina la competencia funcional del espermatozoide y su potencial para fecundar.105 Una desviación de uno o más de los parámetros seminales sobre los rangos de referencia, puede indicar que hay un factor masculino implicado en el problema de esterilidad.106
La correlación de la fragmentación del ADN con los parámetros seminales convencionales ha llevado a conclusiones ambiguas.107 La mayoría de los estudios demuestra una correlación inversa entre la tasa de fragmentación del ADN y la calidad espermática (concentración, motilidad, vitalidad y morfología) sin importar la edad de los sujetos examinados.108,109,110,111,112
Se ha establecido una relación entre el porcentaje de espermatozoides morfológicamente anormales y fragmentación del ADN.110,113 Estructuras anormales de cromatina y roturas de cadena de ADN se correlacionan con formas severas de anormalidades morfológicas como la megalocefalia y múltiples colas114 o la incidencia de globozoospermia acompañada de tasas altas de aneuploidia.115
En contraste, otros estudios no han demostrado relación alguna entre las variables seminales tradicionales como la concentración espermática, motilidad o morfología estricta y los índices de fragmentación del ADN.32,116,117 Hay evidencia además, que en grupos específicos de pacientes como aquellos portadores de translocaciones o que padecen algún tipo de cáncer, las aberraciones cromosómicas espermáticas no siempre se acompañan de características seminales anormales.118
En una revisión reciente por Evgeni y su grupo101 explican que una desviación de uno o más de los parámetros seminales sobre los rangos de referencia no necesariamente implica infertilidad, las limitantes inherentes de estos métodos de evaluación en combinación con la naturaleza variable del semen humano y el nivel de experiencia de los laboratorios seminales115,119 puede generar que se sobrelapen los varones fértiles con aquellos que experimentan infertilidad.32,102,120 Es por esto que subrayan la necesidad de pruebas que investiguen la integridad funcional y molecular del espermatozoide.105
Por lo que se refiere al tema de controversia entre la correlación de los parámetros seminales convencionales y la fragmentación del ADN, Evgeni y su grupo101 enumeran los siguientes factores que influyen en el tema:
Variabilidad en los métodos para evaluar la integridad del ADN.121 La mayoría de los estudios utiliza diferentes métodos para evaluar el daño sobre al ADN y esto no genera resultados comparables.
Variabilidad en la metodología y los criterios aplicados en el análisis de los parámetros seminales convencionales.121 Las diferentes técnicas que existen para evaluar la cuenta espermática y la morfología pueden afectar la precisión de los resultados.
Control de calidad en las pruebas seminales.101 Raramente se menciona si las pruebas seminales se sometieron a un esquema de control de calidad, con el propósito de asegurar la exactitud y disminuir la subjetividad en los resultados.
Falta de uniformidad en los criterios de selección para los grupos estudiados.122 Es posible que los resultados de diferentes subgrupos de pacientes no sean siempre comparables.
Fragmentación del ADN y tabaquismo
El tabaco es reconocido como un riesgo para la salud y su consumo permanece ampliamente difundido en la sociedad,123 es conocido que los fumadores están expuestos a más de 4000 componentes tóxicos derivados del tabaco.124 Estudios epidemiológicos clásicos, evidencian los efectos relacionados a la dosis de consumo, tanto en el varón como en la mujer, que resultan en el retraso de concepción de alrededor de dos meses125,126 y en el adelanto de la menopausia.127
Durante la combustión del tabaco se forma benzopireno, un compuesto que es metabolizado por enzimas del grupo P450 a benzopireno-diol-epóxido (BPDE), el cual tiene el potencial de unirse covalentemente con el ADN formando compuestos denominados aductos.128 En los espermatozoides, se observa un incremento de estos compuestos en el ADN de pacientes fumadores.129
El principal alcaloide del tabaco es la nicotina, está presente en cantidades que varían entre 0.8 y 1.8 mg por cigarrillo dependiendo de la marca y el tamaño del mismo.130,131 La cotinina, su principal metabolito, es un compuesto más estable que la nicotina y tiene una vida media de 20 horas (la de la nicotina es de 2 hrs). En el varón, se detecta nicotina y/o cotinina en el plasma seminal de varones según su grado de consumo.132,133,134 Esto indica que el metabolito atraviesa la barrera hemato-testicular.
Los constituyentes del tabaco reaccionan directamente con el espermatozoide dañando al ADN . Algunas de las formas de daño son las siguientes:
Alteración del número de cromosomas. A través de un mecanismo de disrupción de la función del huso meiótico del espermatozoide.
8-hidroxidexyguanosina (8-OHdG). Un metabolito principal del daño al ADN, sus concentraciones se correlacionan con el tabaco y la cotinina plasmática seminal.
Cadmio y nicotina/cotinina, se incorporan al ADN y forman uniones covalentes por lo que la transmisión del ADN alterado de espermatozoides de fumadores a su descendencia, se asocia con un aumento al riesgo de cáncer infantil123
Daño oxidativo. Debido a la generación de especies reactivas de oxígeno como anión superóxido, peróxido de hidrógeno y radicales libres. Se sabe que además los radicales libres tienen capacidad de unirse al ADN y producir nudos.
Transmisión genética. Debido que el espermatozoide eyaculado tiene una mínima capacidad reparadora,135 la formación de aductos relacionados con el tabaco es una fuente potencial de daño al ADN. En un estudio de 27 embriones preimplantatorios en el estadio de 4-8 células, la proporción de blastómeras que reaccionaron a la presencia de benzopireno fue mayor en embriones de parejas fumadoras (padre, madre o ambos) que en embriones de aquellas parejas sin ningún progenitor fumador.136
La transmisión paterna del daño al ADN puede comprometer el desarrollo embrionario in útero, llevando a fallo de implantación, pérdida gestacional temprana o alteraciones del desarrollo postnatal.123
Sepaniak y sus colegas no encuentran diferencias entre los parámetros seminales básicos (motilidad, viabilidad y morfología) de varones fumadores y no fumadores, sin embargo, hay una diferencia estadísticamente significativa entre el grado de fragmentación de ADN nuclear a favor de los pacientes fumadores (32%) en contra de los no fumadores (25.9%), p < 0.01.137
Niu y sus equipo (2010)138 revisaron 784 casos de infertilidad masculina agrupando los pacientes en no fumadores y fumadores, cuánto fumaban (menos de 10, 11-19 y más 20 cigarrillos al día) y por cuánto tiempo han fumado (menos de 5, 6-9 y más de 10 años). La fragmentación de ADN fue medida por SCSA y citometría de flujo. El índice de fragmentación del ADN fue significativamente superior en el grupo de fumadores (p < 0.05), encontrando además correlación con la tasa de malformación espermática (r = 0.31, p < 0.05).
Fragmentación del ADN y reproducción asistida
El efecto de altos niveles de fragmentación del ADN espermático en términos de reproducción asistida es controvertido. Si hablamos de espermatozoides provenientes del eyaculado, se ha demostrado repetidamente que el daño al ADN evaluado por TUNEL o COMET se correlaciona negativamente (significancia estadística) con la fertilización y tasa de embarazo tras la fertilización in vitro.87,139
Algunos estudios sugieren que utilizando la inyección intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI) se puede mejorar la tasa de embarazo clínico en varones con un alto nivel de fragmentación de ADN espermático5,11,77,140 mientras que otros presentan resultados contradictorios.85,141,142
Después de haber establecido que una proporción importante de espermatozoides móviles en varones con infertilidad presenta fragmentación del ADN, Lopes y colaboradores96 evalúan la presencia de ADN fragmentado tanto en ovocitos como espermatozoides mediante la prueba de TUNEL. Para su estudio, desarrollado en Toronto, Canadá, obtienen 102 ovocitos en los cuales se practicó ICSI y ninguno mostró evidencia morfológica de fertilización a las 18-20 horas del procedimiento. De los 102 ovocitos, en 17 no se observó presencia de ADN paterno; en 26 de ellos se observaron espermatozoides que permanecían condensados, y por último, en 33 espermatozoides hubo descondensación de la cromatina. Una cuarta parte del total (26 espermatozoides) presenta fragmentación del ADN espermático, un hecho que implica la importancia de la selección espermática previa al ICSI.96
Evenson y Wixon,140 revisan 17 estudios (n=2109) donde miden la fragmentación de ADN a través de tres técnicas, SCSA, TUNEL y comet. Observan que parejas sin problemas de fertilidad y parejas con infertilidad tratadas con inseminación intrauterina y que presentan un índice de fragmentación del ADN (DFI) <30% tienen 7.0 y 7.3 veces más probabilidades de alcanzar un embarazo/parto que aquellas con DFI mayor. Es importante definir que este resultado solo se observa cuando se utiliza SCSA como técnica de medición de fragmentación del ADN espermático.
En el meta-análisis por Li y cols,143 en donde incluyen ocho estudios (cinco donde se mide fragmentación ADN espermático por TUNEL y tres mediante SCSA) con una muestra de 299 casos, la tasa de embarazo clínico en FIV convencional disminuye en pacientes con alto grado de daño espermático de manera significativa comparando con aquellos que no presentan alteraciones en el ADN (RR 1.17, IC 95% 1.07-1.28, p=0.0005). Sin embargo, este efecto solo es demostrable utilizando TUNEL como técnica de cuantificación para el ADN.
Zini y cols,144 tras revisar 28 estudios (n=3226), asocian el daño al ADN espermático con una pobre calidad y alteraciones en el desarrollo de embriones resultantes de FIV, ICSI o ambos.
Más recientemente en 2014, Osman y cols82 realizaron un meta-análisis sobre los efectos de la fragmentación del ADN espermático en la tasa de nacido vivo posterior a FIV convencional o ICSI. Analizaron seis estudios que presentaban todos los criterios de inclusión (n=998), tres de ellos miden los niveles de fragmentación de ADN espermático por SCSA, dos por TUNEL y 1 por comet. Concluyen que la tasa de nacido vivo, posterior a FIV convencional, se incrementa de manera significativa en parejas con baja fragmentación espermática comparada con aquellas con un alto grado de fragmentación (RR 1.17, IC 95% 1.07-1.28, p=0.0005).
En otra revisión sistematica y meta-análisis, por Zhao y cols,6 después de revisar 16 estudios de cohortes (3106 parejas) muestran que altos niveles de fragmentación del ADN espermático tienen un efecto deletéreo sobre los resultados de FIV/ICSI (baja tasa de embarazo e incremento en tasa de aborto) y concluyen que las pruebas para medir y valorar el daño al ADN deben ser recomendadas en aquellos casos con fallo repetido en lograr un embarazo.
En el Cuadro 1 se resume las conclusiones de los principales meta-análisis.
* DFI: DNA Fragmentation Index (índice de fragmentación del ADN)
Cuadro 1 Meta-análisis de fragmentación del ADN y reproducción asistida.
El uso de ICSI ha prevalecido sobre la FIV convencional en varones con una alta fragmentación de ADN. Los mejores resultados se atribuyen en parte al proceso de selección de espermatozoides móviles morfológicamente normales.82 También se ha propuesto que la esperada alta proporción de mujeres sanas en el grupo de tratamientos con ICSI provee de ovocitos de mejor calidad que reparen el ADN alterado.77
No obstante, la alta tasa de aborto espontáneo que se reporta tanto en FIV convencional como en ICSI en varones con altos niveles de fragmentación espermática comparado a aquellos con poca o nula fragmentación, sugiere que el efecto dañino persiste sin importar la técnica utilizada.36,145 Esto hace cuestionarse las teorías sobre mejores resultados clínicos por la técnica de ICSI.
DISCUSIÓN
Podemos afirmar que la fertilización de ovocitos metafase II por espermatozoides con daño en el ADN se traduce en defectos del desarrollo embrionario, fallo de implantación y alta tasa de aborto.81,85,146,147,148,149,150 Aunque los ovocitos maduros reparen en cierto grado el daño del ADN espermático, este no es el caso en la mayoría de las pacientes que vemos en la consulta de un centro de reproducción.
Si tomamos en cuenta que los altos niveles de fragmentación del ADN espermático influyen de manera negativa en los resultados de reproducción asistida, el mejorar la calidad de la muestra y la selección de un espermatozoide sano parecen ser las medidas en donde enfocar el manejo.
Mejorar calidad de la muestra espermática
Si tomamos en cuenta que una de las principales causas de fragmentación del ADN espermático son los radicales libres de oxígeno [28, 34] y que el tabaco contiene altas concentraciones de radicales libres e induce la producción celular de especies reactivas de oxígeno,151-152 será por lo tanto de suma importancia, el cese del consumo de tabaco por el varón.
Santos y cols153 observaron una mejoría estadísticamente significativa en los parámetros seminales de varones que suspendieron el consumo de tabaco por tres meses con respecto a los valores previos encontrados en el seminograma. Describen una mejoría en la cuenta de espermatozoides por eyaculado de 29 millones a 72 millones, la motilidad mejora de un 33% a un 79% y la cuenta de espermatozoides grado A después de swim-up aumentó de 3 millones a 23 millones por eyaculado.
Es importante el apoyo integral sobre el varón y su pareja para el cese del consumo de tabaco. Existen muchas opciones como el apoyo psicológico, terapia farmacológica e incluso acupuntura y medicina alternativa. En este último caso, la acupuntura ha demostrado tener buenos resultados;154 sin embargo, un meta-análisis reciente155 concluye que la evidencia no es consistente y libre de sesgo, por lo que sugieren el desarrollo de nuevos estudios aleatorizados y controlados para tomar conclusiones definitivas.
Preparación de la muestra seminal
El primer paso en la selección del espermatozoide para utilizar en una técnica de reproducción asistida, es la preparación del semen. De las técnicas que se utilizan actualmente, la centrifugación en gradientes con swim-up es el procedimiento que consigue la mayor disminución en la tasa de fragmentación de ADN espermático.156 Estos hallazgos han sido confirmados por diversos investigadores.157,158
Esto se traduce en que la misma preparación espermática para trabajar la muestra seminal y realizar alguna técnica de reproducción asistida, nos mejora la calidad del semen sin necesidad de utilizar otro procedimiento costoso y complejo.
Por otra parte, ha sido desarrollado un método de separación de espermatozoides que utiliza anexina V para fijar los espermatozoides con daño en su ADN, dejando la muestra enriquecida con espermatozoides cuyo ADN está íntegro y preparada para ser utilizada en el procedimiento de reproducción asistida.159 Distintos autores han comunicado buenos resultados con el uso de esta técnica.160,161,162,163
El mismo concepto de seleccionar espermatozoides que han llevado una espermatogénesis normal, es la prueba conocida como unión a ácido hialurónico (HA). El espermatozoide humano que se une al HA presenta características similares a aquellos que se unen a la zona pelúcida: mínima fragmentación del ADN, forma normal, baja frecuencia de aneuploidías cromosómicas.120 Jakab y cols164 observaron que la selección de espermatozoides unidos a HA disminuye de manera significativa el porcentaje de espermatozoides que muestran marcadores proteicos de apoptosis y aneuploidias.
Aunque se han observado buenos resultados cuando se compara ICSI convencional contra ICSI con espermatozoide unido a HA como en el estudio de Parmegiani y cols,165 Tarozzi y cols166 afirman su falta de utilidad en el contexto del uso limitado de ovocitos debido a la ley italiana. En una revisión por Sakkas 2013167 se sugiere que aunque los resultados clínicos son prometedores, esta técnica no es tan efectiva si el varón presenta una muy baja cuenta espermática y/o motilidad.
Tipo de daño, extensión y reparación del ADN espermático
La fragmentación del ADN puede ser de cadena sencilla o doble,34 esto tiene implicaciones debido a que el daño de cadena doble se relaciona con inestabilidad genómica, fragmentación de los cromosomas, pérdida de dominios en los cromosomas, translocaciones, desarreglos y muerte celular, haciéndolo más difícil de reparar y con un peor pronóstico para el desarrollo e implantación del embrión.28,64
A pesar de estudios como el de Greco y cols,49 en donde muestra que la microinyección con espermatozoides que presentan fragmentación del ADN superior a 15% (TUNEL) presentan tasas de embarazo del 5.6% contra el 44.4% si la fragmentación es menor al 6%, no se ha logrado determinar la cantidad de daño exacta que puede ser reparada, ya sea por el ovocito o el blastocisto.
Ahmadi y cols168 sugieren que el ovocito tiene la capacidad de reparar daño al ADN espermático en no más de un 8%. Son muchos los factores que intervienen para poder confirmar este valor. Lo que si está claro, es que la capacidad depende no solamente del tipo de daño y la extensión, sino también de la maquinaria intrínseca del ovocito.
Hay básicamente tres opciones que pueden ocurrir una vez que la célula experimenta daño al ADN:28 1) activación de los mecanismos de apoptosis, lo que culmina en la muerte celular; 2) soportar el daño, esto puede llevar a mutaciones para la siguiente generación; y 3) reparar la lesión, activar los mecanismos de protección que corrigen los daños al ADN.
Debido a que un espermatozoide maduro no es capaz de activar mecanismos de reparación propios, la responsabilidad recae en el ovocito. Podemos afirmar que la deleción o errores en la secuencia a causa de una reparación parcial del ovocito, nos resulta en una descendencia anormal. Se sabe que el 80% de las aberraciones estructurales cromosómicas de novo en el humano, son de origen paterno.28
En el 2009, Jaroudi y cols,169 mediante análisis por microarray detectaron un gran número de genes "reparadores" indicando que todas las vías de reparación del ADN son potencialmente funcionales en ovocitos y blastocistos humanos. No hay información que nos diga si es posible incrementar la capacidad de reparación del ADN del ovocito, pero lo que si está claro es que conforme aumenta la edad materna, el RNA mensajero almacenado en los ovocitos disminuye y con ello, la reparación eficiente del ADN.170
FIV o ICSI
Una de las decisiones más controvertidas en el laboratorio es decidir si llevar a cabo FIV convencional o ICSI para la fecundación de ovocitos.
La hipótesis de que la selección natural del espermatozoide que ocurre en una FIV conlleva a la selección de un espermatozoide con menos daño del ADN es demostrada por Borini y cols.85 Ellos encontraron que al analizar 82 ciclos de FIV y 50 ciclos de ICSI hay una relación entre los altos índices de fragmentación de ADN espermático y las tasas de embarazo clínico y aborto observada solamente en el grupo de ICSI (P=0.007 y P=0.009, respectivamente). Otros autores no han obtenido resultados similares, demostrando tasas bajas de embarazo clínico en pacientes con altos niveles de fragmentación sin importar la técnica utilizada.141,171
Además, las altas tasas de aborto espontáneo que se observan tanto en FIV como en ICSI en varones con un alto grado de fragmentación del ADN espermático comparados con varones con bajo grado de fragmentación, sugieren que el efecto negativo persiste sin importar el método de fertilización.36,145
Aunque es una muestra pequeña, un estudio reciente por Ming y cols., compara 164 ciclos con ovocitos de hermanas y el uso combinado de FIV/ICSI. Reporta mejores resultados con el uso de ICSI que la FIV convencional, en términos de porcentaje de clivaje (98.99 vs 96.81%), porcentaje de embriones bloqueados (13.95 vs 20%) y porcentaje de fertilización anormal 0.854 vs 3.63%).172
La decisión sobre qué técnica es superior, FIV o ICSI, es discutible. No obstante, lo que si podemos afirmar, es que el uso de ICSI ha superado por más del doble al de la FIV convencional en Europa.173 Sin embargo, los porcentajes de embarazo y de nacido vivo, son ligeramente superiores con esta última modalidad.173
Selección espermática
Tal vez la clave para descartar espermatozoides con daño al ADN no recaiga en las pruebas de fragmentación del ADN espermático, sino en seleccionar aquellos que demuestren las mejores características y propiedades.
No es el propósito de esta revisión el profundizar en este tema, por lo que recomendamos diferentes lecturas como el trabajo de Sakkas y cols.174 del 2015 donde hacen una revisión de la selección espermática fisiológica y las técnicas utilizadas actualmente en los laboratorios de reproducción asistida además de algunas que están en desarrollo. Podemos destacar técnicas como la unión de espermatozoides al ácido hialurónico, la selección espermática a través de microscopía de alta magnificación (6600x, IMSI), unión a anexina V, y también presentan una breve descripción sobre las técnicas "omics", como la transcriptómica, proteómica y metabolómica.174
CONCLUSIÓN
No cabe ninguna duda que la integridad del genoma de ambos gametos es crucial para lograr un embarazo exitoso que culmine con un recién nacido vivo sano. El papel de las pruebas actuales utilizadas para detectar y cuantificar los daños del ADN sobre el espermatozoide dista mucho de ser esencial debido a la falta de estándares, reproducibilidad y complejidad para realizarlas. Además, uno de los mayores obstáculos es que el uso de alguna de estas técnicas no es clínicamente útil, solo predictivo.
El avance en el conocimiento de la fisiología espermática y el desarrollo de nuevas y mejores técnicas de selección de espermatozoides para su uso en reproducción asistida, nos llevarán a cumplir la meta deseada sopesando de esta manera, el gran obstáculo que representa actualmente la gran complejidad del genoma humano.
