Obtención del callo de Bouvardia ternifolia a partir de hojas e inflorescencias

Los callos de B. ternifolia fueron establecidos partiendo de hojas jóvenes e inflorescencias de plantas de trompetilla colectadas en Ciudad Universitaria (UNAM).

Método de desinfección de hojas e inflorescencias

Las hojas jóvenes e inflorescencias fueron lavadas con agua y jabón. Éstas se pusieron en una caja Petri con etanol al 70 % por 1 min y se lavaron tres veces con agua esterilizada. Posteriormente, se colocaron en agitación constante con una disolución al 20 % de hipoclorito de sodio comercial (NaClO con 6 % de ingrediente activo), 0.1 % de tween y 10 µL de Mycrodyn®, por 20 minutos, se lavaron tres veces con agua esterilizada. Después a las hojas e inflorescencias se les adicionaron 250 mL de Promil ® (2g/250 mL) y esta mezcla se agitó por 30 min, se enjuagaron tres veces más con agua esterilizada. Al cabo de este tiempo se adicionaron 250 mL of Agrimicin® 1 g/250 mL y se agitaron por 20 min, posteriormente se enjuagaron cuatro veces con agua esterilizada.

Siembra de explantes e inducción de callo

Las hojas y flores (explantes) se pusieron en una disolución 1:1 de ácido ascórbico y cítrico (100 mg/L). Las hojas se cortaron en segmentos de 1 cm² y las flores se cortaron en cuatro segmentos colocándolas en el medio de cultivo Murashige and Skoog (MS) (^{Sánchez & Fernández, 1983}) suplementado con sacarosa (3 %), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D,1 mg/L), ácido ascórbico (50 mg/L)- ácido cítrico (50 mg/L), quinetina (0.05 mg/L), cefotaxime (250 mg/L) y gelzan ^TM CM como agente gelante (2.5 g/L), se ajustó el pH 5.7. Las condiciones de incubación fueron 25 ± 2 º C, con 16 horas de luz y 8 de obscuridad. El primer subcultivo se realizó después de tres semanas, el callo se conservó en medio MS sólido y se subcultivó cada tres semanas (21 días, Figura 4).

Figura 4 Callo de inflorescencias (IF) y hojas de B. ternifolia (H). 

Obtención de cultivos celulares en suspensión

El medio que se usó fue el mismo pero sin gelzan^TM CM, el cultivo se estableció por inoculación de 10 g de callo de hojas en un matraz Erlenmeyer con 250 mL del medio MS antes descrito, las condiciones de incubación son las mismas que se describieron anteriormente para la generación de callos, pero bajo agitación constante (150 rpm). Las células fueron subcultivadas por intervalos de 14 días. Al cabo de este tiempo este cultivo se filtró al vacío y se tomaron 20 g de estas células con las que se realizó la biotransformación.

Adicionalmente, se obtuvieron cultivos de células en suspensión de B. ternifolia de hoja en estrés nutritivo, para lo cual se utilizó el medio antes descrito, pero se redujo el porcentaje de nitratos del medio a un 50 % y 25 %.

Biotransformación con callo disgregado en una solución amortiguadora de fosfatos

Se pesaron 20 g de callo de hoja y otro de inflorescencias y se adicionaron a un matraz Erlenmeyer que contenía 100 mL de solución amortiguadora de fosfatos 0.1 M pH 6, la mezcla se agitó a 150 rpm en un agitador rotatorio. Posteriormente, a cada matraz se agregaron 25 mg (1.52 X 10^-4 moles) de isoeugenol que previamente se disolvió en 1 mL de acetona, se adicionó o no agua oxigenada (34.5 µL, 3.04 X 10^-4 moles) según el experimento. En todos los casos la reacción se realizó por triplicado, se usó un control que contuvo sólo los callos disgregados en el amortiguador de fosfatos y otro al que se adicionó todo excepto el sustrato. Las mezclas de reacción se colocaron en agitación a 180 rpm durante 48 horas, al término de este tiempo, se filtró la suspensión de reacción para separar el sólido y el líquido y al filtrado se le hicieron dos extracciones con acetato de etilo (AcOEt, 50 mL x 2), se deshidrataron con sulfato de sodio anhidro (Na₂SO₄) y se evaporaron a sequedad. Una muestra de la mezcla de reacción se analizó por HPLC bajo las condiciones que se describieron en el procedimiento general, ver resultados en la Tabla I. Las mezclas de reacción de las tres repeticiones se juntaron y se purificaron por cromatografía en columna.

El mismo procedimiento se realizó (Tabla II) para el callo obtenido en condiciones de estrés nutritivo.

Biotransformación con el sobrenadante obtenido después de homogeneizar y centrifugar

Se pesaron 20 g de callo de hojas y 20 g de las células del cultivo en suspensión que se obtuvieron por filtración al vacío según se describió anteriormente. Estos callos o células se adicionaron a un matraz Erlenmeyer que contenía 100 mL de solución amortiguadora de fosfatos 0.1 M pH 6, y se homogeneizaron con ayuda de un homogeneizador Ultra-turrax IKA T10, se centrifugó a 1500 rpm por 2 min. Se recuperó el sobrenadante y éste se utilizó para la biotransformación de isoeugenol, para lo cual se adicionaron 25 mg de isoeugenol previamente disuelto en 1 mL de acetona y H₂O₂ (34.5 µL, 3.04 X 10-4 moles) según sea el caso, la reacción se realizó por triplicado y dos controles: uno de ellos con sólo el sobrenadante y al otro se le adicionó todo excepto el sustrato. Las mezclas de reacción se pusieron en agitación continua a 180 rpm durante 48 horas, al término de este tiempo, se filtraron, para separar sólidos y al filtrado se le realizó una extracción con AcOEt (50 mL x 2), se secaron con Na₂SO₄ y se evaporaron a sequedad, Figura 3. Una muestra de la mezcla de reacción se analizó por HPLC bajo las condiciones que se describieron en el procedimiento general, ver resultados en la Tabla I y III.

El mismo método se efectuó para los callos y células en suspensión que crecieron en condiciones de estrés nutritivo (con 50 % y 25 % de nitratos).

Purificación del dehidrodiisoeugenol producido en la biotransformación

La mezcla de reacción se purificó por cromatografía en columna usando como soporte sílica gel y como eluyente una mezcla de diclorometano-hexano 1:1, se tomaron fracciones de 25 mL, siguiendo la purificación por CCF reuniendo las primeras fracciones que contienen el isoeugenol recuperado y las fracciones posteriores en las que se eluyó al producto de la biotransformación del dehidrodiisoeugenol (40 % de rendimiento), se evaporaron a sequedad y el producto fue identificado por RMN¹H. ¹H RMN (CDCl₃/TMS): δ 1.37 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 1.86 (dd, 3H, J = 6.8, 1.6 Hz, 3.40-3.50 (m, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 5.09 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 5.80 (s, 1H), 6.11 (dq, 1H, J = 15.6, 110, 6.4 Hz), 6.36 (dd, 1H, J = 15.6, 1.2 Hz), 6.76 (s, 1H), 6.78 (s, 1H), 111, 6.86-6.91 (m, 2H), 6.96 (s, 1H); (Ramachandra & Ravishankar, 1999) CRMN (CDCl₃/TMS): δ 17.4, 18.4, 45.5, 55.7, 55.8, 93.5, 108.6, 108.8, 113, 113.8, 119.6, 123.2, 130.5, 131.6. Los datos son consistentes con los reportados en la literatura (^{Bartolomeazzi et al., 2010}).

Obtención de cultivos de Bouvardia ternifolia de hojas e inflorescencias

Los callos que se obtuvieron a partir de las hojas e inflorescencias presentaron una coloración crema y aspecto espumoso, no son susceptibles a la oxidación, son disgregables y aumentan rápidamente su masa en un periodo corto de crecimiento.

Los cultivos en suspensión de B. ternifolia, son de color crema y no presentan oxidación. Se realizó la cinética de crecimiento del cultivo de células en suspensión en peso seco y fresco por 14 días, debido a que se observó un crecimiento acelerado con la formación de agregados que dificultaban la toma de la muestra. En el periodo evaluado se observa que el crecimiento se presenta con una tendencia ascendente y con dos fases: la fase “lag” y la fase de crecimiento exponencial o lineal sin observarse la fase estacionaria. Los resultados obtenidos permiten concluir que los cultivos duplican su peso a los ocho días y lo cuatriplican a los 14 días. Esta etapa de crecimiento fue la seleccionada para efectuar las biotransformaciones.

Biotransformación de isoeugenol con callo disgregado en solución amortiguadora de fosfatos de inflorescencia y hoja

De manera preliminar y para determinar si existe diferencia entre el uso de la hoja y la inflorescencia en la biotransformación de isoeugenol se realizaron las reacciones sin adición de peróxido de hidrógeno utilizando callos disgregados en solución amortiguadora de fosfatos de los dos explantes antes mencionados, las mezclas de reacción de las biotransformaciones fueron aplicadas en una cromatoplaca poniendo isoeugenol y dehidrodiisoeugenol como referencia, observando que en las placas de cromatografía no hubo consumo total de la materia prima, pero sí presencia de productos más polares que el isoeugenol, uno de ellos mayoritario con el mismo R_f el dehidrodiisoeugenol. Los resultados obtenidos indican que no existen diferencias observables entre el uso de los callos de las hojas o el de los callos de las inflorescencias, por lo que se decidió continuar con los cultivos celulares provenientes de las hojas para las demás biotransformaciones, Figura 4.

Biotransformación de isoeugenol con callo disgregado en solución amortiguadora de fosfatos y del sobrenadante

En la Tabla I se describen los resultados obtenidos de la biotransformación de isoeugenol con callos de hojas disgregados en solución amortiguadora de fosfatos y con el sobrenadante, con y sin adición de peróxido de hidrógeno. Se evaluó la influencia del H₂O₂, en la reacción, ya que los reportes indican que la adición de éste puede favorecer la formación de los productos de dimerización, por ser el sustrato de las enzimas peroxidasas. Sin embargo, también es sabido que un exceso del mismo puede disminuir los rendimientos (Figura 2).

Los datos presentados en la Tabla I, indican que se obtienen rendimientos moderados similares para las biotransformaciones con el callo disgregado y los sobrenadantes (45 y 44 %, respectivamente). Pero, para aquellos casos en los que se les adicionó peróxido de hidrógeno a la reacción, la biotransformación con el callo disgregado mostró una caída significativa en el rendimiento (13 %); mientras que con el sobrenadante no hubo tal efecto (44 %). La influencia del peróxido de hidrógeno en esta serie de reacciones no es clara.

Rendimientos similares se obtienen cuando se usa la lacasa cruda y purificada de Rhus vercifera (41 %) (^{Shiba et al., 2000}), pero menores a los resultados obtenidos por ^{Nascimento et al., 2000} con peroxidasa pura de rábano (90 %). Cabe mencionar que la comparación se basa sólo en los rendimientos correpondientes, en el entendido que se trata de enzimas y condiciones de reacción diferentes, debido al interés preparativo de estos compuestos.

Por lo anterior, se puede proponer el mecanismo mostrado en la Figura 2, de acuerdo a lo propuesto por ^{Anita et al., 2014} para guaiacol y por ^{Moussouni et al., 2011}, para el isoeugenol, en lo que respecta a sistemas o-metoxifenoles éste sería el radical formado por la peroxidasa y posteriormente el radical se dimeriza de acuerdo al mecanismo propuesto por ^{Bartolomeazzi et al., 2010} en la reacción de formación de dehidrodiisoeugenol y dehidrodieugenol con DPPH de isoeugenol y eugenol, respectivamente.

Con respecto a la recuperación del isoeugenol, éste disminuye cuando se usan callos disgregados y también cuando se utiliza el sobrenadante en presencia de peróxido de hidrógeno. Esto puede ser debido a que el isoeugenol puede sufrir otras reacciones de acoplamiento oxidativo y formar trímeros, tetrámeros e inclusive polímeros.

Cabe resaltar que los cultivos celulares parecen formar pequeñas cantidades de isoeugenol en las condiciones evaluadas entre 0 y 1 % y de dehidrodiisoeugenol entre 0-3 %, sin embargo, estos resultados pueden también ser debidos al error asociado al método de análisis.

La Tabla II presenta los resultados obtenidos con callo disgregado en solución amortiguadora de fosfato con H₂O₂ obtenidos en un medio donde se disminuyó la cantidad de nitratos a 50 y 25 % (estrés nutritivo), puede observarse que los rendimientos en la obtención de dehidrodiisoeugenol aumentan cuando se disminuye la cantidad de nitrato es decir bajo condiciones de estrés, sin embargo, el incremento no es significativo. Como los resultados son iguales cuando se tiene un 50 % y un 25 % de nitratos en el medio, se decidió seguir el estudio empleando sólo los callos con 25 % de nitratos.

Por último, presentamos una serie de experimentos que se realizaron con células en suspensión de B. ternifolia. Se eligió el uso de células en suspensión, en lugar de callo, con base en resultados previos, donde el uso de células en suspensión incrementa el rendimiento en la obtención de dehidrodieugenol a partir de eugenol con cultivos celulares de B. ternifolia ( ^{Hernández-Vázquez et al., 2011}).

Los resultados de estos experimentos se presentan en la Tabla III, como puede observarse el rendimiento se incrementa de manera importante a 73 y 77 % cuando se usa el sobrenadante obtenido con 100 % y 25 % de nitratos respectivamente. Esto es indicativo de que las células en suspensión son mejores fuentes del biocatalizador que los callos, además que el estrés nutritivo genera un incremento en el rendimiento del dehidrodiisoeugenol. Nuevamente cuando se usa el sobrenadante, adicionando H₂O₂, el rendimiento disminuye a 0 y 46 % para las células en suspensión obtenidas con 100 % y 25 % de nitratos respectivamente.

Los datos descritos indican que el sobrenadante obtenido a partir de células en suspensión, es un biocatalizador eficiente para la transformación de isoeugenol, aunque los rendimientos son menores a los informados por ^{Nascimento et al, 2000} con peroxidasa de rábano pura (90 %).

Cabe resaltar, que en estas series de reacciones se utilizaron crudos enzimáticos, y las condiciones de reacción no fueron optimizadas para lograr el rendimiento máximo. Se determinó que la adición de H₂O₂ tuvo un efecto negativo en el rendimiento en la obtención de dehidrodiisoeugenol en todos los casos, posiblemente por la formación de otros productos como trímeros, tetrámeros o polímeros.