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Introducción
Las células poseen un complejo sistema de tráfico vesicular que organiza tanto el transporte de proteínas y moléculas solubles a través del citoplasma, como de moléculas que son secretadas y que constituyen la base de la comunicación intercelular. En enfermedades cardiovasculares la secreción de dichas moléculas refleja la desregulación en la homeostasis celular, así como la disfunción celular y tisular, pero también pueden ser señales dirigidas a disminuir el daño celular1.
En este sentido, las vesículas extracelulares (VE), en particular los exosomas (EXO), cumplen una función paracrina, ya que al ser liberados al medio extracelular inducen respuestas antiapoptósicas, angiogénicas, inmunomoduladoras y antifibróticas2. Los tipos celulares descritos como fuentes potenciales de EXO con propiedades cardioprotectoras son las células madre mesenquimales, cardiacas, embrionarias y hematopoyéticas3. Los EXO son nanocuerpos lipídicos generados por una doble endocitosis membranal, que se convierten en biocontenedores que transfieren biomoléculas a otras células (proteínas, lípidos, ácido ribonucleico [ARN] y ácido desoxirribonucleico [ADN] no codificante), modificando la función de las células receptoras2,3.
Los ensayos preclínicos en cardioprotección utilizando EXO son alentadores, sin embargo, aún se requiere generar más información para proponer que los efectos mediados por EXO estén directamente relacionados con las moléculas que transportan.
En esta revisión se describen los hallazgos sobre la eficacia cardioprotectora que tienen diferentes moléculas que son transportadas por los EXO, como las caveolinas (Cav), proteínas de choque térmico (HSP, heat shock proteins) y los micro ARN (miARN, miR), así como algunas vías de señalización en las que participan estas moléculas. Se espera generar interés en la relevancia del estudio de los EXO en cardioprotección, motivar el desarrollo de más ensayos preclínicos y dar avance hacia estudios clínicos.
Generalidades de los exosomas
Características de los exosomas
Los EXO son las VE más pequeñas, con un tamaño entre 30-150 nm y una densidad de 1.10-1.14 g/ml4. Se considera que participan en la remoción de proteínas de membrana, además de que su presencia en diferentes tejidos y fluidos corporales sugiere un papel fisiológico y patológico importante en la comunicación intercelular y/o entre órganos5. Entre las proteínas que se eliminan a través de esta vía se encuentran proteínas de la membrana plasmática (MP), como el receptor 1 de transferrina y componentes de «balsas lipídicas» como las tetraspaninas CD9, CD63 y CD814. Estas proteínas se organizan a lo largo de la membrana en regiones específicas de los EXO y se consideran sus biomarcadores más comunes6. Los EXO pueden tener diferente origen celular, por ejemplo: hematopoyético, de células epiteliales, células neurogliales y células cancerosas7; por tanto, dependiendo de su origen celular, los EXO suelen recibir diferentes nombres, como: cardiosomas, vexosomas, prostasomas o tolerosomas8. Los EXO se encuentran en diferentes tipos de fluidos corporales, incluidos sangre, saliva, orina, semen, líquido amniótico, leche materna, líquido cefalorraquídeo, bilis, liquido de ascitis9 y líquido pericárdico10.
Biogénesis de los exosomas
Inicialmente la MP debe sufrir un proceso de endocitosis; por macropicnocitosis, dependiente de proteínas como la clatrina, la flotilina, la GEEC (glycosylphosphotidylinositol-anchored protein enriched early endosomal compartments) o mediada por caveolas11. Al compartimento internalizado se le conoce como endosoma temprano, el cual madura en endosoma tardío y acumula vesículas intraluminales (VIL), por lo que también recibe el nombre de endosoma multivesicular (EMV). Las VIL se forman por invaginación de la membrana del EMV, internalizando proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y citosol12 (Fig. 1).
Figura 1 Sistema endomembranal implicado en la biogénesis exosomal. Los exosomas se generan a partir de la compartimentalización dinámica de la membrana plasmática (MP), que permite la internalización de macromoléculas, proteínas de superficie, ligandos y componentes celulares y que posteriormente son reciclados hacia la MP, degradados y/o excretados. La carga exosomal engloba diferentes clases de lípidos, material genético, enzimas, proteínas membranales y del citosol.ESCRT: Endosomal sorting complex required for transport.
Hasta el momento se han sugerido dos principales rutas para la formación de VIL. La primera se conoce como vía dependiente del complejo endosomal de clasificación requerido para el transporte (ESCRT, endosomal sorting complex required for transport), que es un complejo compuesto por cinco estructuras multiproteicas (ESCRT-0, ESCRT-I, ESCRT-II, ESCRT-III más el complejo Vps4), las cuales trabajan en coordinación para facilitar la gemación vesicular y la selección de la carga6. Al finalizar el proceso, los complejos ESCRT y moléculas relacionadas regresan al citosol, para su reutilización13.
La segunda vía implica a la esfingomielinasa neutral (nSMase2)14, la cual genera ceramida a partir de esfingomielina. Se ha demostrado que la ceramida induce la unión de microdominios en dominios más grandes, promoviendo la formación de «brotes» en la membrana y la importancia de esta vía radica en que la expresión a la baja de la nSMase2 reduce la liberación de EXO12.
Contenido exosomal
La carga exosomal presenta características comunes con otros tipos de VE, sin embargo, gracias a diversos análisis se han identificado componentes más específicos15. Incluso se ha determinado que esto depende del tipo celular del cual son secretados16. En la tabla 1 se enlistan algunos componentes de la estructura y contenido exosomal.
Tabla 1 Componentes exosomales comunes
| Tipo | Categoría | Ejemplos | Ref. | |
|---|---|---|---|---|
| Proteínas | Tetraspaninas | CD9, CD37, CD53, CD55, CD63, CD81, CD82 | 6, 17 | |
| Proteínas de citoesqueleto | Actina, tubulina, cofilina-1, moesina, miosina, vimentina, erzina, radixina, perlecán, fibronectina, THBS1, IQGAP1, queratina | 6, 17, 18 | ||
| De biogénesis | ESCRT-0, I, II, III, Her, Vps4, TSG101, alix, flotilina, clatrina | 6 | ||
| De transporte y fusión | Proteína relacionada con RAS 5 y 7, anexinas I, II, IV, V, VI, dinamina, sintaxina-3, RAB4, 5, 7 y 11, RAP1B, RABGDI, SLC3A2, CLIC1 | 6, 17, 18 | ||
| Proteínas de choque térmico | αB-cristalina, HSP20, HSP22, HSP27, HSP40, HSP60, HSP70, HSP90, HSC70, HSPA5, CCT2 | 6, 18, 19, 20 | ||
| De adhesión | ICAM-1, integrinas, lactaderina, MFGE8, P-selectina | 6, 17 | ||
| Antígenos de presentación | Antígeno leucocitario humano tipo I y II | 6 | ||
| Proteínas de señalización | GTPasa, HRAS, sintenina-1, Gi2a, proteínas 14-3-3, ARF1, CDC42, NRAS, EHD1, EHD4, RAN, PEBP1, MIF, RRAS2, estomatina, PDCD6 | 6, 17, 18 | ||
| De transporte | Receptor de transferrina | 6 | ||
| Enzimas | Glucosa-6-fosfato isomerasa, ácido graso sintasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, PFKL, peroxiredoxina-1, hexocinasa, fosfoglicerato cinasa-1, fosfoglicerato mutasa 1, piruvato cinasa, isoenzimas M1/M2, ATP citrato liasa, ATPasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, aspartato aminotransferasa, aldehído reductasa, enolasa-1, lactato deshidrogenasa, aldolasa-1, dipeptidil peptidasa-4 | 6, 17, 18, 21 | ||
| Citocinas | Factor de necrosis tumoral alfa | 6 | ||
| Antiapoptosis | Alix, tiorredoxina peroxidasa | 17 | ||
| Reguladores de transcripción | EEF1A1, EEF2, LGALS3, EEF1A2 | 18 | ||
| Caveolares | Caveolina-1, caveolina-3 | 22 | ||
| Lípidos | Fosfolípidos | Fosfatidilcolina, fosfatidilserina, lisofosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, ácido lisobifosfatídico | 23 | |
| Colesterol | 23 | |||
| Ceramida | 14, 23 | |||
| Esfingolípidos | Esfingomielina, hexosilceramida, lactosilceramida | 17 | ||
| Gangliósidos | GM1, GM3 | 24, 25 | ||
| Otros | Acido araquidónico, prostaglandina E, 15-d prostaglandina J2, diacilglicerol, triacilglicerol, hexadecilglicerol | 23, 26 | ||
| Ácidos nucleicos | ARN | miARN | Let-7, miR-1, miR-15, miR--16, mi-17, mi-R-18, miR-19-19b, miR-20, miR-21, miR-29a, miR-126, miR-143, miR-145, miR-151, miR-155, miR-181, miR-200, miR- 214, miR-320, miR- 375, miR-382 | 6, 23 |
| ARNm, ARN circ, ARNmit, ARNt, ARNsp, ARNp. | 6, 27 | |||
| ADN | ADNmt, ADNcs, ADNcd, ADN viral | 27 | ||
- Proteínas: los EXO se destacan por contener proteínas membranales, citosólicas y de la matriz extracelular de aproximadamente 4,400 clases diferentes6, sin embargo, contienen pocas proteínas del complejo de Golgi, del retículo endoplásmico, del núcleo y de mitocondrias16. Las proteínas mayormente reportadas son estructurales, como actina, cofilina-1 y tubulina, HSP, integrinas, enzimas metabólicas, tetraspaninas, proteínas relacionadas con el tráfico de vesículas como TSG101 (tumor susceptibility 101) y la proteína ALIX, antígenos de superficie, proteínas inmunomoduladoras, proteasas y moléculas angiogénicas, entre otras28.
- Lípidos: independientemente de su origen celular, los EXO están enriquecidos en colesterol, esfingomielina y fosfolípidos, formando balsas lipídicas en su membrana29. Los lípidos son parte esencial de la estructura vesicular, por lo que se han detectado hasta 280 especies lipídicas exosomales30. Los EXO poseen mayor rigidez membranal comparado con la MP, ya que contienen más fosfolípidos desaturados y por una relación lípidos/proteínas elevada, por lo que no se degradan fácilmente y pueden circular de forma libre en los fluidos biológicos31.
- Ácidos nucleicos: los EXO contienen ADN y ARN no codificantes; ADNcs, ADNcd, ARNm, ARNt, ARNcirc, ARNmt, ARNp; sin embargo, los miARN o ExomiRs32 son el tipo de ARN más abundante en EXO plasmáticos humanos6, incluso en proporciones superiores con respecto a su célula de origen, debido a mecanismos de selectividad que operan durante el empaquetamiento de la carga33. Actualmente sabemos que el transporte de miARN puede darse a través de lipoproteínas de alta densidad o por unión a proteínas argonauta 2 y nucleofosmina 134. Se ha reportado que los miARN exosomales están involucrados en procesos de angiogénesis, hematopoyesis y oncogénesis, y que algunos solo se expresan durante enfermedades cardiovasculares35. Las características lipídicas mencionadas anteriormente protegen al ADN y ARN de la degradación mediada por desoxirribonucleasas y ribonucleasas presentes en todos los fluidos corporales32.
Relevancia del origen celular y del contenido de los exosomas en cardioprotección
La composición de la carga exosomal se ha relacionado con la respuesta específica del tipo celular a diferentes estímulos36, al estado fisiológico o patológico de la célula donadora y a los mecanismos de biogénesis4. Por ejemplo, se ha observado que la administración de EXO séricos y plasmáticos no logra estimular la señalización protectora de ERK1/2 (extracelular signal-regulated kinase 1 y 2) sobre cardiomiocitos en condiciones de hiperglucemia, mientras que en normoglucemia se activa esta cinasa a través del receptor tipo toll-4 (TLR4) y HSP2737. Por otro lado, la aplicación de EXO purificados de plasma de ratas sometidas a acondicionamiento isquémico remoto disminuyen el tamaño del infarto en un modelo de daño por isquemia-reperfusión (I/R)38. De igual forma, las VE obtenidas del plasma de ratas sometidas a ejercicio mostraron efectos protectores contra la lesión por I/R39. En cuanto al origen celular de estas estructuras, se ha reportado que los provenientes de líquido pericárdico mejoran la función vascular, estimulan la angiogénesis en modelos in vivo de isquemia, disminuyen la necrosis y aumentan la densidad vascular en la zona afectada10. Otros estudios han demostrado que los EXO de células mesenquimales troncales derivados de tejido adiposo disminuyen la necrosis y apoptosis en modelos in vivo e in vitro de I/R, tras la activación de la vía de señalización Wnt/b-catenina40 y que no solo los EXO derivados de tejido adiposo, sino también los producidos por médula ósea y cordón umbilical reducen la apoptosis y promueven la angiogénesis tras el infarto al miocardio41. En la figura 2 se ilustra el efecto cardioprotector (directo o indirecto) de algunas estructuras y proteínas exosomales.
Figura 2 Efectos cardioprotectores regulados por exosomas. El contenido exosomal formado por múltiples biomoléculas desencadena un mensaje determinado en células y tejidos específicos, activando/inhibiendo vías de señalización que protegen la función cardiovascular. Entre estas vías destacan: la inhibición de LONP1, que mantiene la función mitocondrial; la inactivación de caspasas, vía Bax, que regulan procesos de apoptosis; el bloqueo de citocinas proinflamatorias (IL-6, TNF-α) y la vía p38/MAPK en células inmunitarias; la actividad antifibrótica por inhibición de CTGF; la angiogénesis mediada por VGEF y eNOS, y la activación de vías comunes de cardioprotección que incluyen a PTEN, Akt y ERK1/2.Akt: proteína cinasa B; Bax: proteína X asociada a Bcl-2; CASP 3 y 9: caspasas 3 y 9; CTGF: factor de crecimiento de tejido conectivo; eNOS: sintasa de óxido nítrico endotelial; ERK1/2: cinasa regulada por señal extracelular 1 y 2; IL 6 y 10: interleucinas 6 y 10; JNK: cinasas c-Jun N-terminal; LONP1: peptidasa Lon 1; MAPK: cinasa activada por mitógenos; PKA: proteína cinasa A; PKG: proteína cinasa G; PTEN: fosfatidilinositol- 3,4,5-trisfosfato 3-fosfatasa; TNF-α: factor de necrosis tumoral alfa; VGEF: factor de crecimiento endotelial vascular.
Caveolas y caveolina
La endocitosis mediada por caveolas es una ruta para la formación de EMV y finalmente de EXO. Las caveolas son invaginaciones de la MP consideradas como un subtipo de «balsas lipídicas», que resultan de las interacciones entre colesterol, esfingolípidos y esfingomielina42. Estos nanodominios de 50-100 nm se encuentran enriquecidos en diferentes tipos celulares, principalmente células endoteliales, fibroblastos, adipocitos y células musculares43. Las proteínas integrales de la caveola son las Cav: Cav-1a, Cav-1b, Cav-2a, Cav-2b y Cav-344. Diversos estudios reportan que las caveolas, la Cav-1 y la Cav-3 son esenciales para la protección contra el daño por I/R45. Se ha propuesto que las caveolas tienen un efecto mecanoprotector y que ante un aumento de las fuerzas hemodinámicas (gasto cardiaco), las caveolas presentes en endotelio pulmonar y músculo cardiaco sufren un aplanamiento, aumentando la superficie celular y liberando el exceso de tensión, protegiendo a las células de la ruptura celular46. Por otro lado, si las caveolas se forman e internalizan tras el cierre membranal, pueden transportar diversas proteínas hacia blancos intracelulares, ya que poseen dominios de andamiaje para el anclaje y regulación de diversas moléculas regulatorias y de señalización47.
La Cav-1 es el principal componente estructural de la caveola se expresa predominantemente en células diferenciadas como células endoteliales, adipocitos, músculo liso y neumocitos tipo 148. Se ha demostrado la importancia de la Cav-1 en cardioprotección, ya que atenúa la disfunción cardiaca inducida por neutrófilos49 y se sobreexpresa en terapias farmacológicas50. Por otro lado, Mierke, et al. sugieren una interacción coordinada de Cav-1 y la sintasa de óxido nítrico endotelial en la disminución de la capa íntima vascular, en la reestenosis y en la lesión del vaso en un modelo de trasplante vascular51. En modelos de isquemia cerebral y de extremidades, el efecto angiogénico de Cav-1 se ha relacionado con el factor de crecimiento endotelial vascular y su receptor52; con base en ello, sería interesante evaluar esta relación en la cardiopatía isquémica.
También se ha descrito la presencia de ARNm de Cav-1 en suero y plasma de pacientes con diferentes patologías y aunque la presencia de Cav-1 en el espacio extracelular ha sido poco estudiado, se relaciona con daño celular agudo inducido por hipoxia en algunos tejidos, particularmente en riñón53. Se sugiere que el desprendimiento de la Cav de la MP es resultado del daño hipóxico a la estructura caveolar. Por otro lado, la Cav-3 es una proteína presente únicamente en células musculares estriadas, donde regula la síntesis de óxido nítrico, la contracción del miocito y el metabolismo del colesterol54. Feiner, et al. demostraron que los niveles de Cav-3 se reducen en un modelo murino de insuficiencia cardiaca izquierda y en insuficiencia cardiaca humana55. La Cav-3 es esencial para la protección cardiaca inducida por el receptor de opioides d durante el preacondicionamiento56, mientras que la tolerancia a la I/R está asociada a la expresión de Cav-357. Durante el estrés cardiaco la autofagia regula la adaptación al daño celular, el cual parece depender de la Cav-3, logrando preservar la función mitocondrial y evitar la apoptosis58. Por otro lado, la Cav-3 interactúa con la adiponectina, formando un complejo AdipoR1/Cav-3, el cual confiere cardioprotección mediante la cinasa activada por monofosfato de adenina59. A la fecha no se ha reportado la presencia de Cav-3 en EXO de plasma humano.
Proteínas de choque térmico
Las HSP son moléculas ubicuas inducibles durante eventos de estrés celular, encargadas del plegamiento, ensamblaje, translocación y degradación de proteínas60. En EXO y VE se ha descrito que algunas isoformas de las HSP participan en la comunicación intercelular en condiciones de cardioprotección15. Por ejemplo, la HSP20 que se expresa en el músculo esquelético, cardiaco y liso, regula de forma transitoria la respuesta al estrés celular61. Se ha demostrado que al ser fosforilada por la proteína cinasa A y por la proteína cinasa G, inhibe la actividad de caspasa-3 (CASP-3), disminuyendo la apoptosis62. Los mismos autores sugieren que su efecto cardioprotector en un modelo de I/R se relaciona con el bloqueo de la vía Bax (Bcl-2-associated X protein)/CASP-363, por lo que su activación puede ser un punto clave de protección en la cardiopatía isquémica. También se la asocia con la reducción de la cardiotoxicidad en pacientes con cáncer tratados con doxorubicina64.
Las isoformas HSP60 y HSP70 se expresan en el tejido cardiaco; durante la hipoxia estas proteínas se desacoplan de Bax, permitiendo su translocación a las mitocondrias, donde al formar poros en la membrana favorecen la liberación de citocromo c, que en el citosol activará la vía de caspasas y la muerte por apoptosis. Existe también una forma de HSP60 mitocondrial, que evita la degradación de proteínas mitocondriales vía LONP1 (Lon peptidase 1). La disminución o deleción de HSP60 mitocondrial genera disfunción mitocondrial y una subsecuente dilatación e insuficiencia cardiaca65. El HSP60 de origen exosomal se une con el TLR4, promoviendo la liberación de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) e interleucina-6 (IL-6)65. También se ha reportado que la HSP70 extracelular puede ser útil para predecir la supervivencia de los pacientes con insuficiencia cardiaca, ya que el aumento de los niveles de HSP70 en pacientes con insuficiencia cardiaca se asocia con una mayor mortalidad66. Recientemente se ha documentado la sobreexpresión de HSP70 a nivel vascular en modelos de actividad física, en donde se previene la disfunción endotelial y se mantiene la musculatura vascular coronaria sana, capaz de proteger el miocardio ante insultos isquémicos67. Por otro lado, el consumo moderado de alcohol también se ha asociado con protección cardiaca postinfarto, y se sugiere que podría estar mediado por HSP70, hemooxigenasa 1 y superóxido dismutasa de manganeso, cuya sobreexpresión disminuye el tamaño del infarto y mejora la función ventricular68. Estos resultados correlacionan con los reportados por Guisasola, et al., quien demuestra que el consumo regular de alcohol aumenta los niveles de anticuerpos anti-HSP60, estimulando la producción de citocinas proinflamatorias y disminuyendo la cardioprotección69.
Citocinas
Las células inmunitarias participan en diversos eventos postisquémicos: regulan la eliminación de residuos celulares, favorecen la inflamación y estimulan la formación de tejido de cicatrización. Se ha reportado que los EXO de cardiomiocitos expuestos a isquemia estimulan la diferenciación de células dendríticas de médula ósea. Estas, a su vez, liberan EXO capaces de programar a las células CD4+T, que al secretar quimiocinas y mediadores inflamatorios contribuyen a mejorar la función cardiaca postinfarto70. También se sabe que miARN derivados de macrófagos promueven la inflamación cardiaca incrementando las IL-1b e IL-6, el TNF-a y el CCL2 (ligando de quimiocinas 2), y que específicamente los EXO derivados de macrófagos que contienen miR-155 disminuyen la proliferación de fibroblastos y aumentan la respuesta inflamatoria, lo que podría dañar los procesos de reparación tras el infarto al miocardio71. Estos datos enfatizan la dualidad de la respuesta inflamatoria y la necesidad de su oportuna regulación en el tiempo, ya que, en las fases tempranas del infarto, esta respuesta contribuye a mejorar la tasa de supervivencia promoviendo la reparación del tejido cardiaco; mientras que su descontrol lleva a la muerte celular y a la falla en el remodelaje cardiaco tras el aumento en la producción de especies reactivas de oxígeno, metaloproteinasas y citocinas proinflamatorias.
Es evidente el potencial terapéutico de estas y otras VE, pero también hay muchas preguntas que aún no se contestan en relación con la respuesta inflamatoria, por ejemplo: cuáles son los mecanismos que subyacen en el empacamiento y liberación de citocinas, si las formas asociadas a VE difieren de las formas libres en cuanto a función y si su aplicación alogénica o autóloga es segura en términos de inmunogenicidad en pacientes con enfermedades cardiovasculares.
miARN exosomales
Los miARN son una clase de ARN no codificante que controlan la expresión de algunos ARNm complementarios. Su presencia en suero y plasma sugiere que los miARN pueden cumplir funciones biológicas y genéticas en condiciones fisiopatológicas72. Particularmente, el estudio de miR-21 y su derivado miR-21-5p en EXO provenientes de células madre mesenquimales ha demostrado que tienen efectos paracrinos positivos en la supervivencia celular y en la angiogénesis, favoreciendo la recuperación del miocardio y la regeneración vascular posteriores al infarto del miocardio73. De forma importante, el miR-21 ejerce una regulación cardioprotectora a través de la vía de señalización PTEN/Akt (phosphatase and tensin homologue/protein kinase B)73. En este tenor muchos más miARN se han asociado con la protección cardiaca ante eventos hipóxico/isquémicos, por lo que su estudio en EXO aportaría información útil sobre los mecanismos de cardioprotección.
Conclusiones
Cada vez existen más evidencias de que los EXO y otras VE, dependiendo de su origen celular y de los cambios en su contenido, tienen un efecto positivo o negativo en enfermedades cardiovasculares. El estudio de la biología exosomal y en particular de las moléculas que estas vesículas transportan, ayudará a definir nuevos candidatos a biomarcadores de daño cardiaco temprano o tardío, generando nuevas opciones diagnósticas, terapéuticas y pronósticas en el manejo de las patologías cardiovasculares. Sin embargo, ya que el entorno fisiopatológico en que se producen estas vesículas puede modificar su contenido, son indispensables más estudios preclínicos para conocer la composición específica de los EXO y los procesos que regulan su biogénesis, selección de carga, secreción, señalización, además de las vías la intercomunicación celular en enfermedades cardiovasculares.
Existen novedosas nanotecnologías con las que en un futuro próximo se podrían diseñar microvesículas en cantidades suficientes, que lleguen a blancos específicos y cuya carga tenga potencial terapéutico para realizar intervenciones de cardioprotección dirigidas e incluso personalizadas, así como para mejorar y/o producir un efecto sinérgico con las terapias cardioprotectoras existentes.
