Material vegetal

Las partes aéreas Ruta graveolens y Rosmarinus officinalis fueron colectadas en Iturbide, Nuevo León, México. Las cáscaras de nuez (Juglans regia) fueron donadas por la empresa Alanuez ubicada en Linares Nuevo León, México, como producto de deshecho. Las muestras fueron secadas a 60 ºC / 48 h en un horno de secado Yamato DX402C.

Obtención de los extractos

Los extractos EERG y EERO fueron obtenidos por maceración asistida con ultrasonido (BRANSON 3800) a 40 KHz por 60 min a temperatura ambiente a una relación de 1:12.5 sólido: líquido. Se siguió el mismo procedimiento para las cáscaras de nuez, utilizando metanol, el solvente se eliminó en estufa de secado a 60 ºC / 24 h. Finalmente, los extractos se conservaron a 4 °C en viales ámbar hasta su uso.

Tamizaje fitoquímico de los extractos

Los extractos se sometieron a una serie de pruebas químicas coloridas para determinar cualitativamente la presencia de metabolitos secundarios como: insaturaciones (KMnO₄), carbonilo, grupos aromáticos, oxidrilos fenólicos (taninos vegetales), esteroles y triterpenos, carbohidratos, cumarinas, lactonas, sesquiterpenlactonas, alcaloides, flavonoides y saponinas, de acuerdo con ^{Verde-Star et al. (2016)} .

Actividad antioxidante con DPPH•

La capacidad antioxidante de los extractos se determinó por el método de DPPH• la absorbancia se midió a 519 nm en un espectrofotómetro (Jenway 6320D) (^{Gutiérrez et al., 2008}) utilizando ácido ascórbico como control positivo. Se realizaron diluciones seriadas de los extractos y cada concentración se evaluó por triplicado, se aplicó análisis estadístico Probit para determinar concentración inhibitoria media (CI₅₀).

Material biológico

La cepa de Helicobacter pylori ATCC 43504, fue obtenida del laboratorio de Biología Celular y Genética de la Facultad de Ciencias Biológicas, UANL; y conservada a 4 °C en caldo Infusión Cerebro Corazón (ICC, de OXOID).

Efecto bactericida por difusión en disco (Kirby-Bauer)

Para determinar el efecto bactericida se utilizó el método de difusión en disco (^{Hudzicki, 2009}) con algunas modificaciones. El cultivo de H. pylori se realizó en caldo ICC, por 18 h / 37 °C posteriormente el inóculo se estandarizó usando el método de suspensión de colonias hasta alcanzar una turbidez comparable con el tubo de 0.5 de la escala de McFarland, para dar una concentración resultante de 1.5 × 108 UFC/mL, los discos se impregnaron con los extractos a 10 µg/mL utilizando como control negativo etanol y como control positivo gentamicina (cada tratamiento fue realizado por triplicado). Las cajas Petri se incubaron a 40 °C / 24 h. Terminado el periodo de incubación, se midieron y se registraron los halos de inhibición producidos por cada tratamiento.

Concentración mínima inhibitoria (CMI)

Para la determinación de la CMI se utilizó el método de micro dilución (^{CLSI, 2008}) con algunas modificaciones para el cual se utilizaron placas de 96 pozos con 50 µL de caldo ICC estéril y 50 µL de la solución del extracto (10 µg/ mL), se homogeneizaron y realizaron diluciones seriadas, por triplicado, utilizando gentamicina como control positivo (50 µL, 0.3 µg /mL), 50 µL de inóculo como control negativo y 100 µL de caldo ICC como control de crecimiento. La lectura se realizó en un lector de microplacas (EL311, Bio-Tek Instruments) a 570 nm.

Inhibición de la formación de biopelícula

La inhibición de la formación de la biopelícula se midió utilizando el método de tinción con cristal violeta (^{Shao et al., 2019}) los extractos fueron probados a concentraciones de 0.5, 1 y 3 mg/mL realizando cada tratamiento por triplicado, utilizando gentamicina (0.2 mg/mL) como control positivo y etanol como control negativo.

Actividad tóxica sobre Artemia salina

La toxicidad de todos los extractos fue evaluada utilizando el ensayo de letalidad sobre nauplios de A. salina según lo señalado por ^{Meyer y colaboradores (1982)} ; Se realizó un barrido de la actividad de los extractos probando a concentraciones desde 60 hasta 500 ppm, usando como control positivo K₂Cr₂O₇ y como control negativo agua de mar, todos los ensayos se realizaron por triplicado. Las dosis letales medias (DL₅₀) fueron obtenidas utilizando el análisis estadístico Probit.

Obtención y tamizaje fitoquímico de los extractos

El proceso de maceración es una de las técnicas convencionales para la extracción de compuestos bioactivos ampliamente utilizada debido a que es una técnica económica y sencilla (^{Tambun et al., 2021}). El rendimiento más alto se obtuvo de J. regia (47.43 %), seguido de R. graveolens (3.19 %) y finalmente R. officinalis con 0.1 %. (ver Tabla 1). El rendimiento de la extracción es un parámetro que puede verse afectado por factores como: la madurez, temporada de colecta, las características del material vegetal utilizado, técnica y tiempo de extracción, así como el tipo de solvente utilizado, generan diferencias en la efectividad del método de extracción (^{Adam et al., 2019}; ^{Ashraf et al., 2018}). El tamizaje fitoquímico es uno de las técnicas más útiles, rápidas y sencillas para la determinación de principios activos relacionados con diversas actividades biológicas y proporciona bases para el aislamiento específico de compuestos de interés (^{Shaikh y Patil, 2020}). Posterior a la obtención, los extractos se sometieron a una serie de pruebas químicas colorimétricas, las cuales, de manera cualitativa, señalan la presencia de diversos grupos funcionales. Esta técnica no es determinante para probar la presencia o ausencia de los metabolitos secundarios analizados, sino que su utilidad radica en la rapidez con que genera información para la toma de decisiones sobre la efectividad de la extracción, así como sobre las posibilidades de éxito en las actividades a analizar. Los resultados de los extractos en estudio se muestran en la Tabla 2. Los metabolitos encontrados en los extractos concuerdan con lo reportado por ^{Kabubii et al. (2015)} , quien para el tamizaje de R. officinalis reporta la presencia de terpenos, taninos, azúcares, saponinas y flavonoides. De los metabolitos comúnmente encontrados en R. graveolens según ^{Jinous (2012)} se encuentran: cumarinas, alcaloides, terpenoides, flavonoides, saponinas, taninos y glucósidos, los resultados discrepando en su mayoría con lo encontrado en el presente estudio, sólo concuerdan en la presencia de terpenoides y saponinas, la variabilidad en la presencia de los fitoquímicos está relacionada con factores abióticos como la temperatura, salinidad, estacionalidad, ritmo circadiano, altitud, luz, estrés, deficiencia de nutrientes entre otros (^{Verma and Shukla, 2015}). Para el EMJR los metabolitos encontrados concuerdan con lo descrito por ^{Jahanban-Esfahlan y colaboradores (2019)} que mencionan que los principales metabolitos de diversas partes de J. regia son flavonoides y compuestos fenólicos. La presencia de metabolitos secundarios como flavonoides y chalconas se ha relacionado con la inhibición, interrupción o disminución de factores de virulencia producidos por H. pylori (^{Bonifácio et al., 2014}). Así mismo se ha reportado que algunos flavonoides pueden ejercer actividad antimicrobiana directa in vitro, también las catequinas, tienen efecto en procesos generales como el daño a la membrana, la motilidad y la adhesión bacteriana (^{Palacios et al., 2011}).

Actividad antioxidante

Los extractos evaluados mostraron de buena a moderada actividad antioxidante, en la Tabla 3 se enlistan las CI₅₀ obtenidas por cada especie. El EMJR demostró ser el extracto con mejor actividad, comparada con EERO y EERG, incluso mejor que la del ácido ascórbico utilizado como control en este ensayo, la IC₅₀ obtenida para este extracto, es similar a la del extracto acuoso de J. regia obtenido por ^{Aranda-Ventura José et al. (2017)} , así como comparable con la actividad del antioxidante sintético butilhidroxitolueno (BHT) reportada por ^{Elansary y colaboradores (2020)} . ^{Jahanban-Esfahlan y colaboradores (2019)} estudiaron el potencial antioxidante de diversas partes de J. regia incluyendo cáscaras, reportando menor actividad que la encontrada en este estudio. De acuerdo con de la ^{Cruz-Jiménez y colaboradores (2022)}, la IC₅₀ obtenida para EERG muestra que no posee buena actividad en comparación con los extractos en estudio, otros autores reportan para extractos alcohólicos de R. graveolens IC₅₀ mayores que las encontradas en el estudio (^{Elansary et al., 2020}). Los extractos analizados mostraron actividad dosis dependiente como lo mencionan ^{Oliveira y colaboradores (2008)} ; factores como el tiempo entre recolección y extracción, reacciones entre el solvente de extracción y compuestos fenólicos e incluso factores nutrimentales y ecológicos in situ de la planta pueden ser causantes de la poca efectividad como agente antioxidante del extracto (^{Cao et al., 2019}; ^{Srivastava et al., 2021}). Aportar compuestos con actividad antioxidante durante la infección de H. pylori es importante debido a que se producen sustancias reactivas al oxígeno y nitrógeno (ROS y RNS) causantes de inflamación y desencadenantes del desarrollo de cáncer gástrico (^{Butcher et al., 2017}), por lo que la destacada actividad mostrada por el EEJR es un indicativo indirecto de su de su efectividad contra H. pylori.

Actividad tóxica

Los resultados mostrados en la Tabla 4 corresponden a la actividad de los extractos en estudio, la clasificación de toxicidad se asigna de acuerdo con lo establecido por ^{Nguta et al., 2011} donde los extractos pueden clasificarse de acuerdo con su DL₅₀ en: No tóxicos (DL₅₀ ≥ a 1000 µg/ mL), débilmente tóxicos (DL₅₀ de 500 a 1000 µg/mL), moderadamente tóxicos (DL₅₀ de 100 a 500 µg/mL) y fuertemente tóxicos (DL₅₀ ≤ 100 µg/mL). Para extractos hidroalcohólicos de R. officinalis se han reportado valores de DL₅₀ de 470 µg/ mL (^{Kabubii et al., 2015}) y 230 µg/mL (^{Perales Martínez, 2019}) clasificándolos como débilmente tóxicos, coincidiendo con lo obtenido para el EERO en estudio. Para el EMJR se encuentra que las DL₅₀ obtenidas en este estudio son menores a las reportadas por otros autores (^{Aranda-Ventura José et al., 2017}; ^{Martínez-Báez Adbel Z. et al., 2016}), quienes reportan DL₅₀ ≥ 1000 µg/mL, clasificando sus extractos como no tóxico. Referente a las DL₅₀ del EERG se encuentran reportados resultados muy variados que van desde 5.39 µg/mL (^{Hamidi et al., 2014}) hasta 2,200 µg/mL (^{Mahboob et al., 2015}), las diferencias en las dosis reportadas en los diferentes extractos se relacionan con factores abióticos, métodos y solventes utilizados para la extracción que afectan de forma directa el tipo y cantidad de metabolitos presentes y repercuten de forma directa en la actividad que muestra el extracto.

Actividad antibacteriana

La prueba de evaluación bactericida de los extractos sobre H. pylori utilizando el método de difusión en disco demuestra la bacteria presenta sensibilidad moderada a los extractos EERO y EERG, siendo el EERG el extracto con mejor actividad seguido por el EERO, los resultados de los halos de inhibición se muestran en la Tabla 5. ^{Salehi y colaboradores (2018)} reportan para extractos polares de hojas de romero halos de inhibición con valores de 20 mm y CMI de entre 1.25 y 10 mg/mL; para el caso de extractos de ruda reporta zonas de inhibición de 10 mm y CMI de entre 1.25 y 10 mg/mL, ^{Osman y colaboradores (2015)} reportan para R. graveolens CMI menores a 2 mg/mL, valores similares a los obtenidos en el presente estudio. El porcentaje de inhibición ocasionado por los extractos puede verse limitado por las cuestiones de permeabilidad de la célula a compuestos de carácter polar como los que se encuentran en los extractos etanólicos probados, la naturaleza propia de la bacteria (Gram negativa), lo que limita su pase al interior de la célula y condiciona por lo tanto su actividad (^{Gutiérrez García, 2015}).

Actividad sobre la formación de biopelícula

Los extractos que presentaron actividad contra H. pylori fueron utilizados para determinar su actividad sobre la formación de biopelícula. Las pruebas realizadas con los EERO y EERG, mostraron que solo el primero posee actividad para inhibir la formación de la biopelícula, ^{Song y colaboradores (2018)} reportaron la actividad de R. officinalis contra la formación de la biopelícula de bacterias como Streptococcus mutans y Porphyromonas gingivalis a dosis de 0.1 % v/v, teniendo una inhibición del 50 % de la biopelícula. Los valores porcentuales de inhibición obtenidos en el presente estudio, mostrados en la Tabla 6, son consistentes con los obtenidos por ^{Tran Trung et al. (2020)} quienes estudiaron el efecto de la inhibición en la formación de biopelícula por cepas de H. pylori ATCC 43504, reportando porcentajes de inhibición del 39.5 % para la mircetina y entre 52.7 y 85.9 % para la naringenina. La diferencia en las concentraciones utilizadas para obtener el efecto inhibitorio similar, se deben a que el extracto probado en el presente estudio es un extracto crudo.