Material vegetal

En octubre de 2021, durante la época de estiaje, se colectaron 60 plantas de cinco diferentes especies halófitas (Bacopa monnieri (L.) Wettst; Distichlis spicata L.; Heliotropium curassavicum L.; Flaveria trinervia (Spreng.) C. Mohr y Sesuvium verrucosum Raf .), de un área geotérmica conocida como “Los Negritos”, perteneciente al municipio de Villamar, Michoacán, México. El lugar se encuentra a 1540 m.s.n.m, en las coordenadas 20° 01′ 49.7885″ N y -102° 38′ 37.8240″ W. El tipo de vegetación en la zona es herbácea, sumada de una gran variedad de especies halófitas. La zona es utilizada para pastoreo de bovinos y caprinos debido a que una gran parte de sus pastizales es rico en sodio (^{Lastiri-Hernández et al., 2020}).

Durante el proceso de recolección, a las halófitas se les midió su peso fresco con una báscula de la marca Ohaus Compass™ CX y su altura con un flexómetro de la marca Truper®. Las plantas colectadas de B. monnieri tenían un peso fresco promedio (FWp) de 106.18 ± 2.41 g y una altura promedio (hp) de 15.42 ± 1.91 cm. Las plantas de D. spicata tenían un FWp de 101.92 ± 5.76 g y una hp de 58.66 ± 5.47 cm. Las plantas de H. curassavicum tenían un FWp de 109.71 ± 3.29 g y una hp de 26.54 ± 2.65 cm. Las plantas de F. trinervia tenían un FWp de 135.44 ± 6.27 g y una hp de 61.15 ± 5.83 cm. Mientras que las plantas de S. verrucosum tenían un FWp de 114.61 ± 3.89 g y una hp de 34.25 ± 3.44 cm.

Las halófitas recolectadas fueron llevadas al laboratorio y al terreno experimental del Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional, Unidad Michoacán (CIIDIR-IPN, Michoacán). En el laboratorio, el material fue separado e identificado por códigos taxonómicos (^{McVaugh, 1984}; ^{Rzedowski y Rzedowski, 1985}; ^{Beetle et al., 1987}; ^{Espinosa-García y Sarukhán, 1997}) y fue comparado con los especímenes del herbario del CIIDIR-IPN, unidad Michoacán. Las especies se clasificaron por familia, especie, estatus migratorio (nativa, exótica o endémica), ciclo de vida y uso antropogénico (Tabla 1).

Proceso de fitodesalinización

Las halófitas colectadas fueron trasplantadas en bolsas de poliestireno negras que contenían 10 kg de suelo; las bolsas no se perforaron para evitar la lixiviación de las sales. El suelo utilizado tuvo las siguientes características: Vertisol de textura arcillosa (arcilla 61 %, limo 16 %, arena 23 %); conductividad eléctrica (CE) de 8.72 ± 0.21 dS m⁻¹; pH de 7.72 ± 0.05; relación de absorción de sodio (SAR) de 28.92 ± 0.82 (mmol_c L^-1 )^1/2; porcentaje de sodio intercambiable (ESP) de 25.12 ± 1.04; porcentaje de materia orgánica (OM) de 4.32% ± 0.04; densidad aparente (Da) de 1.2 ± 0.05; capacidad de retención de agua (WHC) de 132 % ± 1.4; nitrógeno total de 0.2 % ± 0.03; fósforo disponible de 26.42 ± 0.95 mg kg^-1; carbonatos de 0.85 ± 0.07 mmol_c L^-1; bicarbonatos de 3.56 ± 0.15 mmol_c L^-1; cloruros de 21.37 ± 0.93 mmol_c L^-1 y sulfatos de 126.81 ± 2.25 mmol_c L^-1.

Las halófitas se sometieron a un proceso de fitodesalinización por un periodo de 180 días. Durante este tiempo, las halófitas se regaron cada tercer día con agua del grifo de forma manual para mantener la capacidad de retención de agua al 70 % (1.15 L/ día).

Las características químicas del agua del grifo fueron las siguientes: CE de 300 µS cm^-1 , pH de 7.68, Ca²⁺ de 0.42 mmol L^-1 , Mg²⁺ de 3.57 mmol L^-1 , Na⁺ de 2.75 mmol L^-1 , K⁺ de 0.34 mmol ^-1, Cl^- de 4.23 mmol L^-1 , CO₃ ^-2 de 1.16 mmol L^-1, HCO₃ ^-2 de 3.58 mmol L^-1, SO₄ ^-2 de 2.47 mmol L^-1 , carbonatos de sodio residuales (RSC) de 0.75 mmol L^-1 , SAR de 1.94, ESP de 2.90, salinidad efectiva (SE) de 3.07. Las características microbiológicas del agua potable fueron las siguientes: coliformes totales de 17 NMP/100 mL, coliformes fecales de 3 NMP/100 mL y Escherichia coli de 3 NMP/100 mL.

El proceso de fitodesalinización se realizó en condiciones de invernadero, con una temperatura y humedad relativa promedio de 36/10 °C (día/noche) y 60 % (±10 %), respectivamente.

Capacidad de fitodesalinización (PHC) y contenido total de Na⁺

Al final del proceso de fitodesalinización se tomaron diez plantas de cada especie (Tabla 1) para determinar la PHC y el contenido total de Na⁺. La PHC (Tabla 2) de las halófitas se cuantificó utilizando la cantidad de Na⁺ acumulado en la parte aérea de sus tejidos y el peso seco (DW) obtenido a los 180 d después del trasplante (ddt) (^{Rabhi et al., 2010}).

Para la obtención del DW de las halófitas, éstas se secaron en un horno Terlab® BTC-9100 a 70 °C durante 48 h. Para la obtención del contenido en Na⁺, las halófitas una vez secas, se trituraron y utilizando un microondas Anton Paar Multiwave Go se les realizó una digestión ácida. Los extractos se filtraron a través de papel de filtro y la concentración de Na⁺ se determinó mediante espectroscopía de absorción atómica (^{Allen 1989}) utilizando un espectrómetro SensAA GBC (México).

Preparación de los BFL

En una segunda etapa, se utilizaron biodigestores tipo Batch con capacidad de 60 L por un período de 150 d para la obtención de los BFL (Figura 1). Se utilizó un biodigestor para cada una de las especies halófitas y uno más que correspondió a estiércol bovino (obtenido en Jiquilpan Michoacán), el cual se consideró como referencia. Los BFL se elaboraron a partir de una mezcla en volumen de 1/3 de planta (cortada en segmentos de 1 a 2.5 cm) equivalente a 15.5 L y 2/3 de agua potable equivalente a 31 L, dejando un espacio de cabeza de 15 cm para cada uno de los biodigestores. También, se buscó que el peso de la biomasa fresca (FW) (únicamente de la parte aérea) utilizada en cada biodigestor fuera equitativo, por lo que a cada biodigestor se le añadió 14 ± 0.168 kg de planta; equivalente a 14.6 plantas de la especie B. monnieri, 16.2 plantas de la especie D. spicata, 6.7 plantas de la especie H. curassavicum, 10.3 plantas de la especie F. trinervia y 5.6 plantas de la especie S. verrucosum. El experimento se realizó por triplicado en una misma corrida experimental.

Para completar el proceso de digestión anaerobia, los biodigestores se colocaron en el mismo invernadero donde se realizó el proceso de fitodesalinización (Figura 1). El agua de riego utilizada fue la misma que la que se usó durante el proceso de la fitodesalinización.

Figura 1 Proceso de digestión anaeróbica de las diferentes halófitas (AD).  

Figure 1. Anaerobic digestion process of the different halophytes (AD). 

Análisis químico de los BFL

Al término del proceso de la digestión anaerobia (150 días), la parte sólida y líquida de los BFL se separaron por filtración, a través de una malla milimétrica plástica, posteriormente, se tomó una muestra de 500 mL de la fracción líquida de cada biodigestor y se analizaron los siguientes parámetros: pH y CE, carbono orgánico total (Nelson & Sommers, 1983), nitrógeno total Kjeldahl (^{Bremner & Mulvaney, 1982}). Los macronutrientes y micronutrientes, como P, K, Ca, Mg, Na, Cl, S, Fe, Cu, Zn, Mn y B, se determinaron mediante espectrofotometría de absorción atómica (^{Allen, 1989}) utilizando un espectrómetro SensAA. GBC (México). La caracterización química de los BFL se muestra en la Tabla 3.

Viabilidad y germinación de semillas

Capacidad de hidratación de las semillas

La viabilidad de las semillas de zanahoria (D. carota L.), lechuga (L. sativa L.), rábano (R. sativus L.) y pepino (C. sativus L.) se determinó mediante el método de flotación. Las semillas que pasaron la prueba de flotación se usaron para probar su capacidad de hidratación (imbibición) en respuesta a los BFL. En ello, se evaluaron tres concentraciones de BFL: 0.25:5 (5 %), 1:10 (10 %), 1:5 (20 %). Se trabajó con 96 tratamientos (Tabla 4), obtenidos a partir de la combinación de seis tipos de BFL, de las cuatro especies hortícolas (semillas), las tres concentraciones de BFL, y un tratamiento control usando agua destilada estéril, para cada una de las especies hortícolas. El experimento se repitió cinco veces (96 x 5). Las semillas utilizadas en la investigación fueron semillas certificadas de la marca; Rancho Los Molinos.

Para la imbibición, se pesaron (por tratamiento) 20 semillas de la hortaliza correspondiente, las cuales posteriormente se sembraron en cajas Petri y sobre un papel filtro humedecido con 10 mL del tipo y concentración de BFL correspondiente. Posteriormente, las cajas Petri se colocaron en una cámara de germinación (Thermo Scientific), a 25 °C. Pasadas 12 h, las semillas de cada especie y tratamiento se pesaron nuevamente, utilizando una balanza analítica (SA 120, Scientech Inc., CO, EE. UU.).

Germinación de semillas

Después de registrar la capacidad de hidratación (imbibición) de las semillas, las cajas Petri se volvieron a colocar en la cámara de germinación (Thermo Scientific) a 25 °C y 65 % de humedad relativa durante cinco días. Los bioensayos de germinación se realizaron según la metodología propuesta por ^{Zucconi et al., (1981)}.

Pasados los cinco días, se evaluó el porcentaje de germinación relativo (PGR), el crecimiento relativo de la radícula (CRR), el índice de germinación (IG) (^{Tiquia, 2010}) y la longitud total de las plántulas (LT) de cada especie (raíz + hipocótilo) en mm, la cual se registró con un calibrador digital Vernier 14388 de la marca Truper®. Las semillas se consideraron germinadas si la radícula sobresalía a través de la cubierta seminal de la semilla (2 mm) (Figura 2) (^{Pablo-Pérez et al., 2013}).

Figura 2 Efecto del BFL de H. curassavicum en la germinación de pepino (Cucumis sativus L.). a) control, b) concentración de BFL al 5 %, c) concentración de BFL al 10 % y d) concentración de BFL al 20 %.  

Figure 2. Effect of H. curassavicum BFL on cucumber (Cucumis sativus L.) germination. a) control, b) 5 % BFL concentration, c) 10 % BFL concentration and d) 20 % BFL concentration. 

Análisis estadístico

Los datos obtenidos de las variables evaluadas fueron promediados y sometidos a la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk (p ≤ 0.05) y a la prueba de homogeneidad de varianza de Levane. Las variables que cumplieron ambas pruebas se sometieron a un análisis de varianza (ANOVA) y a la prueba de comparación de medias de Tukey (p ≤ 0.05). Las variables que no cumplieron con las pruebas de homogeneidad de varianza o normalidad se transformaron al logaritmo natural (Ln) hasta observar normalidad y homocedasticidad, luego se calcularon las pruebas ANOVA y Tukey (p ≤ 0.05). Los datos que no cumplieron con ambas pruebas se sometieron a un análisis no paramétrico de Kruskal-Wallis y pruebas de suma de rangos de Wilcoxon. Para todos los casos se utilizó el programa estadístico Statistical Analysis System (SAS) versión 9.1 (^{SAS Institute Inc., 2004}).

BFL producidos a partir de halófitas

La eficiencia de los BFL está sujeta diversos factores, como: el método de preparación, el tiempo de DA, la temperatura dentro del biodigestor (mesófila, termófila), el estado fenológico y los microorganismos endógenos de las plantas (^{Bitew y Alemayehu, 2017}; ^{de-Oliveira-Neto et al., 2017}).

Por lo que autores como ^{Kumar-Pramanik et al. (2019)} y ^{Tuszynska et al. (2021)} sugieren periodos de 30 a 70 días para la obtención de los BFL; es el tiempo en que normalmente termina la producción de biogás (^{Pham-Van et al., 2020}). Sin embargo, autores como ^{Pérez-Méndez et al. (2017)}, sugieren un periodo de 120 días, para obtener un BFL estable y maduro. Por lo tanto, en la presente investigación se consideró adecuado un periodo de 150 d, puesto que, de acuerdo con ^{Mupambwa et al. (2020)} largos periodos de degradación generan abonos orgánicos con mayor contenido nutrimental.

De acuerdo con ^{Barampouti et al. (2020)}, los valores de pH para BFL obtenidos a partir de residuos vegetales (plantas), se encuentra entre 7 y 8.4. Valores similares a los obtenidos en la presente investigación (Tabla 3). En cuanto a la CE de los BFL, ^{Valentinuzzi et al. (2020)} reportan un valor de 4.6 dS m^-1 para un BFL obtenido de la Biogas Wipptal plant y un valor de 9.4 dS m^-1 para el obtenido a partir de estiércol bovino; este último valor coincide con el reportado en la presente investigación. Sin embargo, la CE de los BFL obtenidos apartir de halófitas, es mayor a 4.6 dS m^-1 (entre 5.15 y 6.18 dS m^-1) lo cual puede explicarse debido a que presentan un mayor contenido de los cationes: Na⁺, K⁺, Mg²⁺ y Ca²⁺ (^{Santoyo-de-la-Cruz et al., 2021}). Aunque, cabe aclarar que el hecho de que la CE de los BFL sea elevada, no significa que se descarte su potencial función como biofertilizante, pues normalmente los BFL se utilizan disueltos en agua a razones que van del 5 al 25 % (^{Möller & Müller, 2012}; ^{Ladan et al., 2020}).

Otro de los aspectos importantes a considerar es el contenido nutrimental de los BFL. Dicho esto, los BFL obtenidos a partir de halófitas (Tabla 3), presentan concentraciones de N_total, C_total, P, K⁺, Ca²⁺ y Mg²⁺, significativamente menores a las de productos similares elaborados con estiércol bovino, porcino, de cuy y gallinaza (^{Medina et al., 2015}), únicamente comparándose al contenido nutrimental obtenido en BFL de estiércol ovino y al de la Fattoria della Piana, elaborado con estiércol de animales (aves de corral, vacas y ovejas), bagazo de aceituna y pulpa de cítricos (^{Medina et al., 2015}; ^{Panuccio et al., 2019}).

Por otro lado, el aspecto más importante a considerar en los BFL obtenidos a partir de halófitas (T2 al T6; ver tabla 3), es su contenido en Na⁺, el cual supera los 2000 mg L^-1 en todos los tratamientos. Sin embargo, estudios como el realizado por ^{Medina et al. (2015)}, indican que el BFL de estiércol porcino presenta concentraciones de Na⁺ de 3 400 mg L^-1, mientras que BFL elaborados a partir de estiércol bovino (1 040 mg L^-1), ovino (560 mg L^-1) y cuy (542 mg L^-1) presentan concentraciones de Na⁺ considerablemente más bajas. Por otro lado, ^{Panuccio et al. (2021)} reportan concentraciones de 3 500 mg L^-1 de Na⁺ en un BFL obtenido a partir de la combinación de estiércol animal (aves de corral, vacas y ovejas), suero de leche y ensilado de maíz. Por lo tanto, el contenido en Na⁺, de los BFL obtenidos a partir de halófitas, no es elevado.

Imbibición de semillas

Altas concentraciones de NaCl (50, 100 y 200 mM), generan que disminuya la movilidad del agua y, por ende, también la velocidad de imbibición de las semillas, lo que afecta directamente a la síntesis de biopolímeros, proteínas, ácidos nucleicos y la cantidad de hormonas reguladoras de las células vegetales (^{Orlovsky et al., 2016}; ^{Lastiri-Hernández et al., 2017}). En general, estos aspectos limitan la intensidad de los procesos de crecimiento conforme se desarrollan en la posterior etapa de germinación, donde intervienen algunos mecanismos fisiológicos de arranque relacionados con los primeros ciclos de división y diferenciación celular que surgen en el embrión, independientes de los productos de la hidrólisis de las sustancias de reserva de las semillas (^{Obroucheva, 2021}).

Sumado a lo anterior, en la presente investigación, la respuesta diferencial entre las semillas de las diferentes especies (Tabla 5) podría deberse a que cada genotipo requiere un porcentaje crítico de agua para la germinación, producto de la dependencia de la naturaleza química de su reserva y compuestos estructurales (^{Acosta-Motos et al., 2017}), lo cual se pudo verificar cuando las semillas de las diferentes variedades evaluadas mostraron una reducción en su PGR mediante la aplicación de diferentes concentraciones de BFL (Tabla 6).

Sin embargo, las concentraciones de BFL utilizadas (5, 10 y 20 %), representan concentraciones por debajo de 50 mM de NaCl, lo cual explica por qué la disminución en el porcentaje de imbibición no fue drástica (Tabla 5), tal como si sucedió en el trabajo realizado por ^{Lastiri-Hernández et al. (2017)}, donde se utilizaron semillas de especies forrajeras y concentraciones más elevadas de NaCl (50, 100 y 200 mM).

Germinación de semillas hortícolas

La salinidad es uno de los estreses abióticos más comunes que reduce tanto la capacidad de germinación como el potencial de emergencia de diversas especies hortícolas (^{Rouphael et al., 2018}; ^{Sium et al., 2019}; ^{Tarchoun et al., 2022}). En su investigación, ^{Flowers et al. (2015)} han indicado que el aumento de la concentración de iones Na⁺ y Cl^- induce un aumento en la toxicidad iónica, el estrés hídrico y la reducción del potencial osmótico en las semillas, lo que se ve reflejado en la inhibición de la germinación y crecimiento de las especies hortícolas evaluadas; principalmente con concentraciones de BFL al 10 y 20 %, como se pudo comprobar al observar la reducción en su PGR, CRR, IG y LT (Tabla 6).

Sumado a lo anterior, es importante mencionar que los abonos orgánicos, como es el caso de los BFL, pueden presentar metabolitos fitotóxicos. Dicha fitotoxicidad generada por los metabolitos afecta el desarrollo de las especies hortícolas, es decir, pueden limitar el crecimiento de las plantas y también impedir y/o retrasar su germinación (^{Urriola et al., 2021}).

De acuerdo con ^{Emino y Warman, (2004)} y ^{Varnero et al. (2007)}, si el índice de germinación es inferior al 50 %, el material evaluado (en este caso el BFL) presenta una alta fitotoxicidad. Si estuvo entre 50 y 80 %, la fitotoxicidad fue moderada, y si su valor fue mayor a 80 %, el material no presentó fitotoxicidad. Por lo tanto, el presente estudio pudo verificar que, todas las especies hortícolas evaluadas con BFL al 5 % (Tabla 6) no presentaron fitotoxicidad alguna. En cambio, usando los BFL al 10 %, las semillas de L. sativa y D. carota en el T2, T4, T5 y T6 y las semillas de C. sativus en los T4 y T6, mostraron toxicidad moderada. Mientras que, usando los BFL al 20 % las semillas de L. sativa en los T4 y T6 presentaron una alta toxicidad. De acuerdo con ^{Sarker et al. (2014)} las semillas de R. sativus L., en presencia de un nivel de salinidad de 2 dS m^-1 presentan un PGR=100 %, mientras que con un nivel de 4 dS m^-1 presentan un PGR= 86.67 %. En la presente investigación, todos los BFL evaluados al 5, 10 y 20 %, se encuentran dentro de dicho intervalo; excepto los T4 y T6 usando BFL al 20 %, los cuales se encuentran cercanos a un nivel de salinidad de 8 dS m^-1. En cuanto al IG, los resultados de los BFL al 5, 10 y 20 %, fueron similares a los obtenidos por ^{Krishnasamy et al. (2014)} usando extractos de vermicompost (aserrín + biosol (desechos vegetales)), pero se encontraron por encima de los resultados obtenidos por ^{Lastiri-Hernández et al. (2023)} usando extractos de compost y vermicompost de S. verrucosum; ambas combinadas con diferentes cantidades de estiércol bovino. Respecto al CRR y LT, los resultados obtenidos con los BFL a partir de halófitas fueron significativamente mayores a los obtenidos por ^{Sarker et al. (2014)}.

Respecto a las semillas de L. sativa L., el PGR, IG, CRR y LT obtenido en todos los tratamientos, utilizando los BFL al 5 % (Tabla 6), se asemejan a los resultados presentados por ^{Medina et al. (2015)} usando un BFL realizado a partir de estiércol ovino. Sin embargo, los resultados utilizando los BFL al 10 y 20 % se encuentran muy por debajo de los reportados por ^{Medina et al. (2015)}. Por otro lado, para el PGR, ^{Reina et al. (2020)} usando una concentración salina de 0.045 M de NaCl, reporta resultados que representan un decremento aproximado del 40 %, comparado con los obtenidos con los BFL al 5 %, pero muy similares a los obtenidos usando los BFL al 10 y 20 %.

Hablando de C. sativus L., los resultados de PGR obtenidos en todos los tratamientos con BFL al 5, 10 y 20 %, son similares a los reportados por ^{Abdel-Farid et al. (2020)} usando respectivamente una concentración salina de 25, 50 y 100 mM de NaCl. Respecto a IG, CRR y LT, los resultados obtenidos con los BFL tanto al 5, 10 y 20 % (Tabla 6), son significativamente menores a los obtenidos por ^{Baghbani et al. (2013)} usando diferentes concentraciones salinas.

En cambio, en el caso particular de D. carota L.,^{Bolton y Simon, (2019)}, reportan valores de PGR de 81.6 % utilizando una concentración salina de 150 mM, por lo cual, en la presente investigación solo los BFL usados al 5 % y los T1 y T3 usando los BFL al 10 %, superan dicho valor de PGR. El resto de los tratamientos usando BFL al 10 % y todos los tratamientos con BFL al 20 %, se encuentran considerablemente por debajo.

Al comparar los resultados, es evidente que la respuesta frente a los BFL realizados, depende de la variación genética del germoplasma estudiado y su tolerancia a la salinidad (^{Tarchoun et al., 2022}).