Área de colecta

Se colectaron frutos de aguacate en huertos de los ejidos La Yerba, Camichín de Jauja y San Luis de Lozada pertenecientes al municipio de Tepic; asimismo, también se muestreó en el ejido de Xalisco que pertenece al municipio de Xalisco. En cada uno de los municipios indicados anteriormente se tomaron frutos de aguacate con signos de antracnosis directamente del árbol, los cuales se colocaron en bolsas de polietileno de baja densidad y se trasladaron al laboratorio de Tecnología de Alimentos de la Universidad Autónoma de Nayarit.

Aislamiento y caracterización morfológica del hongo fitopatógeno.

Se lavaron los frutos, hojas y flores con agua destilada y hipoclorito de sodio al 1% para eliminar polvo y contaminantes externos, secando después con toallas de papel. Posteriormente, se hicieron cortes finos de aproximadamente 2 a 3 mm del tejido enfermo, lo que se desinfectaron con una solución de hipoclorito de sodio al 1% por 3 min, enjuagando con agua destilada estéril; por último, se secaron con gasas estériles y se colocaron en cajas petri conteniendo papa dextrosa agar (PDA Dibico), se incubaron a 28 ± 3 °C, con una humedad relativa de 80%, revisando diariamente para observar el desarrollo del patógeno. Se realizaron resiembras sucesivas con PDA para purificar los cultivos del hongo fitopatógenos (^{Arias et al., 2006}; ^{Rondón et al., 2006}; ^{Santander, 2012}).

La caracterización de las cepas del hongo se colocó a través de un disco de PDA con crecimiento del patógeno en una caja Petri con este mismo medio, se incubó durante 7 días a 28 ±3 °C. Para la caracterización de las cepas se evaluó el color al frente, al reverso y del centro de la colonia, textura del micelio, forma de la colonia, tamaño y forma de conidios y el diámetro de la colonia. El diámetro de colonia se determinó midiendo con una regla milimétrica el crecimiento, obteniendo la tasa de crecimiento diario en cm, así como la diferencia del diámetro final menos el diámetro inicial (disco de micelio colocado). Se evaluaron largo y ancho de los conidios que fueron observados por un microscopio compuesto a una magnificación de 40x y midiendo con una reglilla micrométrica. Cincuenta conidios seleccionados al azar de cada uno de los aislamientos fueron medidos. La forma de los conidios se determinó con base en las características indicadas por ^{Sutton (1992)}.

Pruebas de fitopatogenicidad

Una vez que fueron aislados los hongos del aguacate, se llevaron a cabo pruebas para determinar cuáles cepas fueron capaces de generar síntomas de enfermedad en el fruto y así comprobar la capacidad patogénica de los mismos (^{Benbow y Sugar, 1999}).

Los aguacates libres de antracnosis se lavaron y desinfectaron con una solución de hipoclorito de sodio al 1% durante 3 min, enseguida se realizó un lavado con agua destilada estéril y se secó en condiciones de asepsia en una campana de flujo laminar. Se realizaron 2 heridas por fruto con un punzón que permitió generar cavidades de 4 mm de diámetro por 3 mm de profundidad en diferentes zonas. Se adicionó a las heridas una alícuota de 25 µl de la suspensión de esporas de Colletotrichum spp. (1x105 esp mL-1) tomadas de un cultivo con 7 días de crecimiento. Los frutos que fueron tratados únicamente con agua destilada estéril fueron usados como control (^{Benbow y Sugar, 1999}; ^{Bautista, 2013}) . Cinco frutos fueron utilizados para cada una de las veinte cepas y cada uno de ellos se repitió tres veces.

Los aguacates tratados se colocaron en cámaras de plásticos con humedad relativa > 90%, la cual favoreció el desarrollo de estos hongos fitopatógenos. Las cámaras se mantuvieron a temperatura ambiente (28 ± 3 °C aproximadamente) durante 10 días. Se efectuaron revisiones diarias para detectar de forma oportuna la aparición de los signos de la enfermedad (lesiones necróticas) (^{Benbow y Sugar 1999}).

Identificación molecular de los hongos fitopatógenos.

Se utilizó PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para confirmar la identificación de los aislados de Colletotrichum. Se realizó la extracción de ADN de los hongos patógenos mediante la técnica descrita por ^{Sambrook y Russel (2001)}.

LaregiónITS-5.8S-ITS2delrDNAfueamplificadamediantelos iniciadores ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCCTGCGG-3’) e ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) (^{White et al., 1990}).

Las amplificaciones por PCR se realizaron a través de un termoreciclador (Applied Biosystem® GeneAmp® PCR System 9700, California, EUA) con las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 °C por 2 min, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 1 min, alineación a 50 °C por 30 s y una extensión del iniciador a 72 °C por 2 min. Con una extensión final a 72 °C por 10 min. Los productos de la amplificación fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 1% (SIGMA-Aldrich®, Alemania), las cuales se tiñeron con bromuro de metilo (0.2 μg mL-1). Los amplicones de DNA se visualizaron en un transiluminador (BioDoc-IT system image, UVP®, EUA) (^{Ochoa et al., 2007}) y secuenciados (Genewize Inc. New Jersey, EUA). Las secuencias de DNA fueron alineadas en Basic Local Alingment Search Tool (NCBI BLAST) de la base de datos en línea NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nhi.gov/Blast.cgi) (^{Altschul et al., 1997}).

Crecimiento del tubo germinativo y tamaño de esporas de Colletotrichum spp.

Para determinar el porcentaje de germinación y crecimiento del tubo germinativo de esporas de Colletotrichum spp. se empleó la técnica de cultivo en portaobjetos (^{Cai et al., 2009}), se tomaron cortes del cultivo en medio PDA de 10 mm2 y se colocaron sobre un portaobjetos. Luego se depositaron 30 μL de una suspensión de esporas (1x106 esporas. μL-1) sobre los bordes del corte y se cubrió con placas cubreobjetos (^{Johnston y Jones, 1997}). Los cultivos se incubaron durante 8 h a temperatura ambiente (28 °C) y bajo condiciones de elevada humedad en cajas plásticas con tapa (^{Chaky et al., 2001}).

Se registró la longitud y el ancho de 30 esporas y del tubo germinativo de cada aislamiento. Las observaciones y mediciones microscópicas se hicieron bajo un microscopio óptico con una magnificación de 40 x. Las estructuras en cada placa se fotografiaron con el programa (Motic Images Plus 2.0), las imágenes se usaron para medir la longitud y el ancho de las esporas y el tubo germinativo del Colletotrichum spp. (^{Rodríguez et al., 2009}).

La evaluación de patogenicidad se realizó con 10 réplicas por cepa. Los datos obtenidos de la caracterización de cepas del hongo (tamaño del conidio= largo x ancho) y tubo germinativo, así como patogenicidad se evaluaron utilizando un diseño completamente al azar. Los datos se sometieron a un análisis de varianza y comparación múltiple de medias mediante la prueba de Tukey a un nivel de significancia de p≤ 0.05, usando el paquete estadístico Statistic Analysis System (SAS, 2009) versión 9.

Aislamiento del patógeno y la caracterización morfológica

Se aislaron un total de 86 cepas de hongos, entre las que se identificaron 20 cepas de Colletotrichum spp. mediante técnicas moleculares, las cuales fueron identificadas como: C. gloeosporioides (13 cepas), C. hymenocallidis (1 cepa), C. siamense (5 cepas) y C. tropicale (1 cepa) (Cuadro 1). De estas cepas, la especie C. gloeosporioides ha sido reportada en diferentes especies como papaya, cítricos, aguacate, café, mango, uva, guanábana, tomate y fresa (^{Beltrán y García, 2006}). Como también el C. tropicale se han reportado que diversos cultivos han sido afectados, como la guanábana, mango y aguacate entre otros (^{Rojas et al., 2010}).

Sin embargo, el resto de las especies no han sido reportadas para el aguacate, como es el caso del C. hymenocallidis que ha sido reportada principalmente en lirio araña y algunos casos en chile y tomate (^{Yang et al., 2009}). Al igual que el C. siamense no se cuenta con la información si provoca daño al aguacate, pero si en los diversos cultivos como árbol de jaca, árbol de pan, café, higuera, cacao, yerba buena, pimienta negra, romero (^{James et al., 2014}).

Las cepas se agruparon en 8 categorías de acuerdo a sus características morfológicas macroscópicas como el tipo de crecimiento, micelio, color y masa conidial, las cuales se presentan en el Cuadro 1. Todos estos aislamientos presentan características similares a los obtenidos por ^{Rodríguez et al. (2009)} que junto a ^{Pérez et al. (2003)} mencionan que el patógeno causante de la antracosis llamado Colletotrichum spp. tiene gran variabilidad morfológica debido a los parámetros como las condiciones de incubación, temperatura y humedad, sin embargo, en el presente trabajo no se variaron las condiciones ambientales ni de medio de cultivo, por lo que podemos destacar las variaciones que puede haber entre especies e incluso entre cepas de la misma especie, que de acuerdo a ^{Gutiérrez et al. (2001)} puede deberse a la gran plasticidad genética de adaptación a diferentes condiciones.

Fitopatogenicidad en frutos de aguacate

Todos los aislados identificados como Colletotrichum causaron los síntomas de antracnosis en los aguacates inoculados a partir del día seis. La prueba de patogenicidad de los diferentes aislados Colletotrichum spp. demostró que las 20 cepas fueron capaces de generar, a los 10 días después de la inoculación (ddi), los mismos signos de la enfermedad que se presentaron en las lesiones de las que fueron aislados (Figura 1), por lo cual, los re-aislamientos a partir de los aguacates infectados artificialmente comparten las características de las cepas que fueron inoculados, es decir, cumplen con los postulados de Koch.

Figura 1 Daño causado por Colletotrichum spp. en el aguacate ‘Hass’ durante 10 días de incubación. 

En las pruebas in vivo, las cepas ANq (C. siamense) y ANc (C. gloeosporioides) tuvieron el mayor diámetro de desarrollo de los síntomas de la enfermedad, seguido por un grupo de cepas de C. gloeosporioides, C. siamense y de menor virulencia en aguacate se encontraron C. hymenocallidis y C. tropicale, sin embargo, todas las cepas causaron daños considerables al fruto (Figura 2).

Figura 2 Cepas de Colletotrichum spp. evaluadas en el desarrollo de los síntomas de la enfermedad in vivo. 

Las 20 cepas presentan una alta variabilidad morfológica, patogénica y genética, que de acuerdo a ^{Morales et al. (2009)}, está relacionada al lugar donde fue aislado el patógeno. En el presente trabajo, las cepas más patógenas fueron aislados de huertos donde los árboles no se podaban y tenían las condiciones de humedad y temperatura para el desarrollo de los patógenos. ^{Montero et al. (2010)} menciona que la variabilidad del C. gloeosporioides se debe a sus aspectos bioquímicos; mientras que ^{Marroquín et al. (2016)} comenta que existe una gran variabilidad patogénica, lo cual hace que las reacciones diferenciales expresadas en las interacciones de Colletotrichum gloeosporioides sean diferentes.

^{Domínguez et al. (2012)} encontraron que las diferentes especies de Colletotrichum spp. tienen gran variabilidad genética y molecular, causando que el grado de daño sea variable entre ellas. Por esta razón los primeros signos de la antracnosis en la evaluación in vivo comenzaron aparecer entre el tercer y cuarto día de incubación y el daño fue en aumento al comenzar la maduración del fruto, lo que puede deberse a que se trata de una enfermedad latente; es decir, la infección se presenta en estados tempranos del desarrollo del fruto e incluso desde la floración y se mantiene latente hasta que el fruto alcanza las condiciones óptimas como son la máxima producción de etileno, misma que desencadena eventos enzimáticos que estimulan el desarrollo del hongo, así como la disminución de la concentración de algunos compuestos que inhiben el desarrollo del mismo (^{Alarcón y Chavarriaga, 2007}), como lo es el flavonoide epicatequina y otros polifenoles, que mantienen al Colletotrichum spp. en estado latente, sin embargo, durante la maduración del fruto los niveles de este compuesto y otros que son antifúngico disminuyen, lo que provoca la activación del hongo (^{Beno y Prusky 2000}et al., 2005; ^{Rodríguez et al., 2013}), lo que concuerda con lo observado en el presente trabajo.

Crecimiento del tubo germinativo y tamaño de esporas de Colletotrichum spp.

Según los estudios realizados por ^{Adaskaveg y Hartin (1997)}, la morfología es una característica que puede variar de acuerdo al aislado. En el presente estudio, las cepas de Colletotrichum fueron clasificados en cuatro grupos principales con referencia al desarrollo del tubo germinativo durante ocho horas (Figura 3). El primer grupo está integrado por la cepa NAa, la cual presentó un crecimiento de 102.9 µm; el segundo grupo por la cepa NAc (71.6 µm), el tercer grupo por la cepas NAd, NAb, NAf, NAj, NAm, Nag, NAt, NAh, Nai, NAn, NAr, NAq, NAk, y NAs (46.1-22.5 µm), mientras que el cuarto grupo está integrado por las cepas NAl, NAe, NAp y Nao (20.5-9.2 µm). El crecimiento del tubo germinativo más alto a las 8 horas después de la siembra lo presentó Colletotrichum gloeosporioides.

Figura 3 Desarrollo del tubo germinativo de 20 cepas de Colletotrichum spp. aisladas del cultivo de aguacate a 8 h después de la inoculación. 

En relación al tamaño de la espora, se encontró que existe variabilidad tanto en lo largo como en lo ancho de la espora, con un largo entre 14.8 y 33.9 µm, mientras que a lo ancho se tiene un rango que va de 5.2 µm a 8.6 µm.

En el Cuadro 2 se presenta el coeficiente de correlación de Pearson entre las características morfológicas de las esporas y el desarrollo del patógeno, donde se muestra que no hay correlación significativa en el tamaño de la espora y el desarrollo de los hongos in vivo o in vitro (p≤ 0.05); sin embargo, el crecimiento del tubo germinativo presenta una correlación significativa con el desarrollo del patógeno in vitro e in vivo, con un R2 de 0.548 y 0.552 respectivamente (p≤ 0.05).

^{Rodríguez et al. (2013)} mencionan que no se necesita el desarrollo del apresorio para poder hacer daño al hospedero, pero si depende de la germinación y al desarrollo del tubo germinativo para poder formar la síntesis de una capa mucilaginosa que se adhiere al hospedero; al igual ^{Cascino et al. (1990)} y ^{Kim et al. (1999)} mencionan que no todas las especies de Colletotrichum forman apresorio, sino que pueden penetrar directamente con ayuda del tubo germinativo.

Los resultados en este estudio claramente muestran que hay al menos cuatro especies de Colletotrichum patógenas de aguacate, estas especies presentan diversidad morfológica y patogénica incluso entre cepas de la misma especie.