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Introducción
El cultivo de plantas medicinales cada vez es mayor debido al incremento de su uso con fines terapéuticos y en la producción de fórmulas para productos de cuidado personal y salud a base de las mismas. El 40% de la población mexicana usa plantas medicinales como la única alternativa para el tratamiento de enfermedades, siendo el principal recurso terapéutico en México (Fernández et al., 2008). Hoy en día existen manuales de producción de plantas medicinales donde se especifican los requerimientos para el cultivo (CONAFOR, 2009; Villavicencio et al., 2010); sin embargo, no hay un monitoreo de las concentraciones o condiciones del principio activo.
El árnica (Heterotheca inuloides) es una planta comúnmente usada como anti-inflamatorio. Sin embargo, también se usa para el tratamiento del reumatismo, problemas gastrointestinales y actualmente se ha usado como tratamiento alternativo contra el cáncer (Alonso-Castro et al., 2011) y la diabetes (Andrade-Cetto y Heinrich, 2005; Johnson et al., 2006). Los compuestos que le confieren estas propiedades medicinales son principalmente sesquiterpenos, fitoesteroles y flavonides (Delgado et al., 2001). Esta planta se encuentra en las regiones frías y templadas de México (Guerrero-Hernández et al., 2014; Gutiérrez y Solano, 2014). En México, es considerada una de las plantas medicinales de mayor demanda (García de Alba et al., 2012; Juárez-Rosete et al., 2013; Monroy-Ortíz et al., 2013), se obtiene principalmente de manera silvestre, aunque ya se comienza a cultivar en pequeña escala (Cesín-Vargas et al., 2010; Cristians et al., 2015).
Los compuestos activos son los que le confieren las propiedades terapéuticas y aromáticas a dichas plantas. Estos compuestos activos están conformados por metabolitos secundarios, principalmente de compuestos fenólicos que funcionan en la planta contra daño oxidativo y flavonoides que le confieren protección contra patógenos (Ávalos y Pérez-Urria, 2009). De acuerdo con Petinatti (2012), la concentración de los compuestos fenólicos se ve modificada por estrés biótico y abiótico al que se somete la planta. Factores como la temperatura, la radiación, la nutrición y el riego, son factores de estrés abiótico que afectan la concentración de fenoles. Tal es el caso de las plantas Ruta graveolens, donde los fenoles se ven afectados por la radiación UV Vialart et al. (2012).
Además, el estrés hídrico, considerado como estrés abiótico, es estudiado sobre su influencia en la producción de fenoles y flavonoides. Algunas de las plantas estudiadas sobre este tipo de estrés es el plátano (Musa spp.) (Moreno-Bermúdez et al., 2017), arroz (Oryza sativa L.) (Ramírez, 2017), entre otros. Por otro lado, la influencia del estrés abiótico en las plantas aromáticas puede influenciar en compuestos específicos, tal como el efecto de la alta radiación sobre la biosíntesis de carvacrol en orégano en donde se logró incrementar la concentración de este compuesto Teraza et al. (2014). De acuerdo a esto el objetivo de este trabajo es comparar las condiciones de cultivo sobre la producción de fenoles, flavonoides totales y su capacidad antioxidante en el árnica (Heterotheca inuloides).
Materiales y métodos
Para la experimentación de este trabajo, se obtuvieron comercialmente 28 plantas de árnica (Heterotheca inuloides) de un invernadero cercano al campus Amazcala y fueron identificadas por el herbario QMEX. Se trasplantaron en bolsas con sustrato inerte y se dejaron en aclimatación por 5 días.
El experimento se llevó a cabo en el campus Amazcala de la Universidad Autónoma de Querétaro durante un periodo de 28 días. El diseño experimental fue factorial de 2 x 2 x 3; es decir, dos tipos de cultivo, dos tipos de riego y tres concentraciones de elicitor. Se cultivaron 14 plantas en invernadero de tipo gótico con ventilación cenital y 14 plantas en campo, aplicando dos tipos de riego en cada cultivo; el primero consistió en agua con solución nutritiva (fertilizante) y el segundo con agua residual acuícola. Además, se realizó dos elicitaciones cada 14 días con ácido salicílico, a las concentraciones 0.5 mM, 1 mM y un control, siendo el muestreo antes de cada aplicación. La temperatura ambiental (°C) y el (%) de humedad relativa ambiental fueron monitoreadas durante todo el periodo de la experimentación.
Calidad del agua
La calidad del agua fue determinada por métodos espectrofotométricos. El análisis de nitritos (NO2 --N) fue por el método de diazotización (método HACH 8507, 2010), nitratos (NO3 --N) mediante el método de reducción de cadmio (método HACH 8171, 2010) y fósforo total (FT) por el método de molibdovanadato (Método HACH 8048, 2010).
Extracción de compuestos fenólicos
La extracción de compuestos fenólicos totales se realizó por el método de Hassan et al. (2011). Se pesó 0.1 g de muestra y se extrajo primeramente en una solución acuosa con metanol al 50%. Después se realizó una segunda extracción con acetona al 70%. Este método permite la extracción de compuestos extraíbles en metanol y en acetona.
Compuestos fenólicos totales
Los fenoles totales se determinaron espectrofotométricamente por el método de Folin-Ciocalteu descrito por Singlenton y Rossi (1965). Este método se produce por la oxidación de los grupos hidroxilo mediante el reactivo de Folin. Este reactivo está compuesto de una mezcla de wolframato sódico y molibdato sódico en ácido fosfórico. En la determinación de fenoles totales se realizó la solución de carbonato de sodio anhidro al 20% y el reactivo Folin-Ciocalteu se preparó al 1 N. Para la curva de concentración el ácido gálico se preparó a una concentración final de 0.1 mg/ml. La reacción redox producida genera una coloración azul detectada a una longitud de onda de 765 nm.
Flavonoides totales
Para la cuantificación de flavonoides se preparó una solución de 2aminoetildifenilborato y se tomaron 50 μl de la extracción de fenoles, la fracción de fenoles extraíbles, y se les añadió 180 μl de metanol más 20 μl de la solución preparada con 2-aminoetilfenilborato. Se preparó Nitrito de sodio (NaNO2) al 5%, cloruro de aluminio (AlCl3) al 10%, hidróxido de sodio (NaOH) al 1 M y la solución estándar de catequina con metanol. La lectura se realizó en un espectrofotómetro a 404 nm y se obtuvieron las concentraciones de flavonoides con una curva estándar de catequina.
Capacidad antioxidante, DPPH
La capacidad antioxidante por el método DPPH es un método muy usado basado en la donación de un átomo de hidrógeno o en la formación de complejos (DPPH-H y DPPH-R) mediante la estabilidad del radical 1, 1-difenil-2-picrilhidrazil. Las concentraciones de las capacidades antioxidantes para cada planta se determinaron por medio del porcentaje de inhibición (IC50).
La determinación de la capacidad antioxidante por el método DPPH se preparó en reactivo DPPH (1,1-difenil- 2-picrilhidrzil) con metanol. Se preparó en reactivo DPPH con metanol. Se colocaron alícuotas de 1.865 ml del reactivo en microtubos de 2 ml y 0.135 ml del extracto metanólico de cada muestra. Se dejó reposar por 30 min protegido de la luz y se realizó la lectura a una longitud de onda de 480 nm.
Capacidad antioxidante, FRAP
Para la determinación de la capacidad antioxidante por el método de FRAP se preparó el reactivo con la mezcla de una solución 20 mM de tricloruro de hierro (FeCl3), buffer de acetatos con acetato de sodio anhidro y acetato de sodio trihidratado a un pH de 3.7 y por último se preparó TPTZ (tripiridil-2-tiazide) a 10 mM disuelto en ácido clorhídrico al 40 mM. Se colocó 1.865 ml del reactivo FRAP y 0.135 ml del extracto metanólico de las muestras en microtubos de 2 ml. Se dejó reaccionar por 30 min bajo protección de la luz. Se utilizó trolox para la curva de calibración. La lectura de la absorbancia se realizó a una longitud de onda de 630 nm.
Resultados y discusión
Determinación de fenoles totales
Los resultados de la concentración de fenoles totales se muestran en la Figura 3. La concentración máxima de compuestos fenólicos se presentó en las plantas cultivadas en campo, regadas con agua con solución nutritiva y elicitadas a una concentración de 0.5 mM. Sin embargo, no existe una diferencia significativa entre cada concentración de elicitación. Por otra parte, se puede advertir un incremento significativo de la concentración cuando las plantas son elicitadas por primera vez. También, es evidente el efecto del cultivo debido a que las plantas cultivadas en campo presentaron una concentración mayor a diferencia de las plantas cultivadas en invernadero. Estos resultados concuerdan con Petinatti et al. (2012), en donde el estrés abiótico efectivamente modifica la concentración de metabolitos secundarios, en este caso de compuestos fenólicos.
Figura 1 Concentración de compuestos fenólicos totales (mg eq. ác. Gálico/g) en árnica cultivada en diferentes condiciones. Los resultados se expresan en error estándar. 1, 14, 28, días de muestreo y elicitación.
El efecto del cultivo en campo sobre la concentración de compuestos fenólicos puede ser influenciado por las diferentes temperaturas que se observaron en el monitoreo de la temperatura ambiental, observándose temperaturas máximas de 45 °C y mínimas de 1.6 °C. Además, la temperatura ambiental en el invernadero no presenta cambios significativos, manteniendo su rango de temperatura entre 17 °C y 22 °C. Además, se observó el mismo comportamiento en el porcentaje de humedad relativa ambiental. Estos resultados se demuestran en la Figura 2.
Figura 2 A. Temperatura ambiental; y B. Porcentaje de humedad relativa en los dos tipos de cultivo (invernadero y campo) en un ciclo de 24 h.
Por otro lado, el incremento de la concentración de fenoles totales en las plantas regadas con solución nutritiva está relacionada a la concentración de nutrientes suministrados. El análisis de la calidad de agua demostró que la concentración de nitrógeno en el agua con nutrientes es mayor debido a que se preparó de acuerdo a las necesidades de la planta. Estos resultados se presentan en el Cuadro 1. Además, la concentración de fosfatos en la solución nutritiva fue mayor como era de esperarse. La influencia de la nutrición está estudiada en diferentes plantas como en el orégano (Lippia origanoides) en donde el tipo de nutrición incrementa el rendimiento del aceite esencial Teles et al. (2014).
Determinación de flavonoides totales
Las concentraciones de flavonoides totales en las plantas de árnica se presentan en la figura 4. Los resultados muestran un incremento significativo en la concentración de flavonoides totales cuando son cultivados en las diferentes condiciones. Las concentraciones máximas se observan en las plantas cultivadas en invernadero y regadas con solución nutritiva. No se observaron cambios significativos entre las concentraciones elicitadas en cada cultivo. Sin embargo, el mayor incremento de la concentración es cuando las plantas son elicitadas por primera vez.
Figura 4 Concentración de flavonoides totales (mg eq. Catequina/g) en árnica cultivada en diferentes condiciones de cultivo. Los resultados se expresan en error estándar. 1, 14, 28, días de muestreo y elicitación.
Por otro lado, se puede observar que solo en las plantas elicitadas a una concentración de 1 mM se comportaron de manera distinta a las anteriores; es decir, existe un incremento en la concentración de flavonoides cuando las plantas son cultivadas en invernadero, regadas con solución nutritiva y elicitadas en dos ocasiones con ácido salicílico a una concentración de 1 mM. El efecto de la elicitación con ácido salicílico fue el esperado ya que en diferentes plantas tal como el maíz, se ha observado un incremento en la biomasa total, así como el contenido de N, P, K, el contenido de fenoles, flavonoides y de compuestos puntuales como la capasaicina Tucuch-Haas et al. (2017).
Capacidad antioxidante, DPPH
Los resultados de la capacidad antioxidante se presentan en la Figura 5. Las capacidades antioxidantes en las plantas de árnica fueron en incremento en cultivos particulares; es decir, para las plantas cultivadas en campo, regadas con agua con solución nutritiva y elicitadas a 0.0 mM en dos ocasiones, tuvieron un incremento en la capacidad antioxidante. Este resultado se puede atribuir a las variaciones de temperatura y humedad relativa a las que fueron sometidas en el cultivo en campo. Para las plantas cultivadas elicitadas a una concentración de 0.5 mM en dos ocasiones, el incremento de la capacidad antioxidante se presentó en las plantas cultivadas en campo, sin diferencias significativas entre el tipo de cultivo. Estos resultados se pueden atribuir a la respuesta de la planta respecto al tiempo y concentración de elicitación.
Figura 5 Capacidad antioxidante (mg eq. Trolox/g) por el método DPPH en las plantas de árnica cultivada en diferentes condiciones. Los resultados se expresan en error estándar. 14 y 28, días de muestreo y elicitación.
Los resultados de la capacidad antioxidante en las plantas elicitadas a una concentración de 1 mM en dos ocasiones, presentaron un incremento significativo cuando las plantas son cultivadas en campo y regadas con agua residual acuícola y en las plantas cultivadas en invernadero, regadas con solución nutritiva. De acuerdo con Rodríguez et al. (2017), Heterotheca inuloides contiene una gran variedad de sesquiterpenos, flavonoides y terpenos, compuestos que están presentes en la planta de acuerdo a la edad, tiempo de floración e incluso de acuerdo a la región geográfica de origen. Por ejemplo, el cadaleno y el 4-metoxi-isocadaleno, son compuestos que están ausentes en ramas jóvenes de la planta. De acuerdo con esto, atribuimos los resultados de la actividad antioxidante por el método DPPH a la variedad de compuestos que pudieron tener una actividad antioxidante en las diferentes condiciones de cultivo.
Capacidad antioxidante, FRAP
Los resultados de la capacidad antioxidante por el método FRAP se presentan en la Figura 6. La capacidad antioxidante determinada por el método FRAP mostraron diferencias significativas entre el tipo de cultivo, siendo el cultivo en campo con la capacidad antioxidante más alta. Sin embargo, la capacidad antioxidante entre los sistemas de riego fue mayor cuando la planta es regada con solución nutritiva, pero sin efecto por la elicitación (0.0 mM). Por otro lado, la capacidad antioxidante en las plantas elicitadas a una concentración de 0.5 mM por dos ocasiones, fueron mayores cuando se tiene un sistema de riego con agua residual acuícola. De la misma manera se comportó la capacidad antioxidante en las plantas elicitadas a 1 mM en dos ocasiones. Estos resultados muestran que hay un sinergismo entre dos tipos de estrés abiótico, la nutrición y la elicitación.
Figura 6 Capacidad antioxidante (mg eq. Trolox/g) por el método FRAP en las plantas de árnica cultivadas en diferentes condiciones. Los resultados se expresan en error estándar. 14 y 28, días de muestreo y elicitación.
De acuerdo a estos resultados, la capacidad antioxidante está relacionada con el estrés abiótico al que fueron sometidas las plantas de árnica. De acuerdo con Hossain et al. (2010), el método de secado del material vegetal, en este caso en plantas Lamiaceae, tiene una influencia sobre la capacidad antioxidante medida por el método FRAP.
Conclusiones
El cultivo en campo y la concentración del elicitor aplicado incrementa la concentración de compuestos fenólicos. La concentración de flavonoides se incrementó de manera significativa cuando la planta es cultivada en ambos tipos de cultivo (invernadero y campo), teniendo diferencias entre el tipo de riego. La capacidad antioxidante es muy variante al tipo de cultivo en el que se tiene a la planta, esto debido a los compuestos específicos y al tipo de actividad antioxidante que presenten.
