Introducción

El avance en el conocimiento de la regulación hormonal in vitro ha permitido desarrollar protocolos de micropropagación en especies y cultivares de importancia económica como en rosa híbrida Mimosa pudica L. (^{Bianchetti et al., 2017}); (^{Aggarwal et al., 2018}), hasta en algas rojas (^{Villanueva et al., 2013}). El efecto de diferentes concentraciones de fitohormonas en la micropropagación de especies de la familia Cactaceae se ha estudiado en germoplasma en estatus de riesgo de interés para la horticultura ornamental como: en varias especies del género Coryphanta spp. (^{Pérez-Molphe-Bach et al., 1998}), el viejito Cephalocereus senilis (Haw.) Pfeiff. (^{Choreño et al., 2002}), biznaga nido de golondrina Epithelantha micromeris (Engelm.) F. A. C. Weber ex Britt. & Rose (^{Villavicencio et al., 2012}), mamilaria Mammillaria voburnensis Scheer (^{Ordoñez, 2003}), cactus alcachofa Obregonia denegrii Frič & A. Berger (^{Cardarelli et al., 2010}), diversos minicactus del género Turbinicarpus spp. (^{Mata-Rosas et al., 2001}; ^{Dávila et al., 2005}; ^{Villavicencio et al., 2011}) y pitaya Stenocereus stellatus (Pfeiff.) Riccob. (^{Martínez-Villegas et al., 2011}), donde los brotes in vitro se han obtenido usando citocininas solas o combinadas con auxinas.

Se tienen resultados con la interacción de dos citocininas 6-benzylaminopurine (BAP) y 2-isopentenil-adenina (2-iP), en combinación con bajos niveles de auxinas; en otros casos con la interacción de citocinina-auxina como: BAP-ácido α-naftalenacético (ANA), BAP-ácido indol-3-butírico (AIB), 6-furfuryl aminopurine (KIN)-ANA o ácido indol-3-butírico (AIB). Esta variedad de respuestas es función del genotipo y medio de cultivo utilizado. ^{Gonçalves et al. (2016)} mencionan que las citocininas (CK) y auxinas (AUX) han sido utilizadas para regular el crecimiento y desarrollo de tejidos vegetales, pero aún no está claro cómo éstos compuestos influyen en la actividad metabólica de las especies in vitro, donde las concentraciones de CK de 0 hasta 20 μM pueden influir en la funcionalidad del fotosistema (PS) II, en la anatomía de las hojas, densidad estomatal, producción de brotes a partir de meristemos o yemas axilares.

Considerando que el cultivo in vitro de tejidos vegetales se ha convertido en una herramienta muy útil para acelerar los procesos de producción de plantas, su factibilidad dependerá del manejo de los factores que favorecen este proceso, como el medio de cultivo utilizado donde la concentración de nutrientes, hormonas, horas de luz, temperatura, pH, humedad relativa, suministro de oxígeno, entre otros influyen en el desarrollo de las plantas; por lo que la respuesta morfogenética del explante dependerá de la estandarización del protocolo de micropropagación.

Con el propósito de realizar acciones de conservación ex situ, promover el uso y potenciación de material nativo de interés ornamental (^{Espinoza-Flores et al., 2003}; ^{Granada, 2014}; ^{Gámez et al., 2016}), como la biznaga de ornato ‘cono invertido de Viereck’ Turbinicarpus viereckii subsp. major (Glass & R.A. Foster) Glass, originaria del norte de México, que pertenece a la subfamilia Cactoideae y Tribu Cacteae (^{Guzmán et al., 2003}; ^{Hunt, 2006}; ^{Tropicos, 2019}) y que se encuentra en estatus de riesgo de protección especial (Pr) de acuerdo con la NOM-059-ECOL-2010 (^{SEMARNAT, 2010}), se hizo necesario evaluar otros esquemas de propagación no convencional para regenerar esta especie mediante el cultivo in vitro, planteando como objetivo de esta investigación el definir el tipo y dosis de citocininas, así como la relación citocinina-auxina que influyen en la etapa de multiplicación, para seleccionar la relación de fitohormonas que promueve el mayor número de brotes in vitro sin perder la estabilidad del explante y estandarizar el protocolo de micropropagación para regenerar esta especie y producir plantas en cantidades suficientes.

Materiales y métodos

La investigación se realizó en las instalaciones del Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales (LCTV) del Campo Experimental Saltillo CIRNE-INIFAP, ubicado en el municipio de Saltillo, Coahuila, México.

Material vegetal. En la primera etapa se utilizaron vitroplantas germinadas in vitro a partir de semilla colectada en el verano de 2016 en el municipio de Guadalcázar en San Luis Potosí.

Explantes. Cuando las vitroplantas alcanzaron una altura de 10 mm ±1 se hicieron dos cortes para eliminar la zona distal y proximal del tallo, utilizando los segmentos intermedios del tallo (SIT) como explantes. Este tipo de explante se usó en todos los subcultivos posteriores (Figura 1).

Figura 1 Obtención de explantes y establecimiento de tratamientos en la multiplicación de la biznaga de ornato ‘cono invertido de Viereck’ (Turbinicarpus viereckii subsp. major (Glass & R. A. Foster) Glass). 

A partir del segundo subcultivo se usaron los SIT obtenidos a partir de la zona distal de tallo (ZDT) (apical) mismos que se subcultivaron y crecieron en el medio Murashige-Skoog (^{MS; Murashige y Skoog, 1962}) como medio base, reduciendo la mitad (50%) su concentración de macrosales y sin reguladores de crecimiento, para obtener nuevos segmentos intermedios del tallo (SIT) y producir los explantes requeridos en los siguientes subcultivos y continuar con la multiplicación.

Multiplicación de brotes. Los segmentos intermedios del tallo (SIT) usados como explantes fueron establecidos en el medio Murashige-Skoog (^{MS; Murashige y Skoog, 1962}) al 50% de su concentración de macrosales, suplementado con 100 mg L^-1 de mio-inositol (SIGMA^®), 0.4 mg L^-1 de tiamina-HCl (SIGMA^®, T-3906), 1 mg L^-1 de piridoxina -HCL (SIGMA^®, P-8666), 30 g L^-1 de sacarosa (SIGMA^®, K-0753) y 7 g L^-1 de agar (SIGMA^®, A-1296), con 200 mg L^-1 de carbón activado. El pH de medio se ajustó a 5.7 y esterilizó previamente en autoclave marca Felisa a 1.2 kg cm^-2 de presión a 121 °C durante 15 min.

Mediante un diseño experimental completamente al azar con arreglo factorial, se evaluaron dos citocininas: BAP y KIN en cuatro concentraciones 2.5, 5, 7.5 y 10 mg L^-1 en interacción con dos auxinas: ANA y AIB en una relación citocinina-auxina de 10:1. Se establecieron cinco SIT por frasco, con 10 repeticiones por tratamiento y evaluaron en total 16 tratamientos. Esta evaluación se repitió cinco veces mediante subcultivos sucesivos de 2017 a 2019 en el LCTV evaluando cada diez semanas el número de brotes por explante (Nb) y la altura del brote (Ab, mm).

Análisis estadístico. Las variables evaluadas se analizaron mediante el procedimiento PROC GLM del sistema de análisis estadístico SAS, (Versión 9.4) (^{SAS, 2019}), realizando un análisis de varianza (Anova) para determinar el efecto de las fitohormonas (citocininas y auxinas), influencia de la concentración y una prueba de rango múltiple Tukey (p≤ 0.05) considerando los tratamientos como efectos independientes para seleccionar el mejor tratamiento.

Condiciones de incubación. El material vegetativo se estableció en el cuarto de incubación del LCTV considerando un fotoperíodo de 14 h luz por 10 de oscuridad, con una intensidad luminosa de 9-10 μmol seg^-1 m^-2 y una temperatura de 25 ±2 °C.

Aclimatación y transferencia a suelo. Los brotes obtenidos se individualizaron y subcultivaron en un medio MS al 50%, de sus componentes adicionando 1 g L^-1 de carbón activado para inducir el enraizamiento y luego se pasaron a su aclimatación. Las vitroplantas enraizadas fueron lavadas y tratadas con 1 g L^-1 de fungicida sistémico comercial con ingrediente activo N-(triclorometiltio) ciclohex-4-eno-1,2-dicarboximida previo al trasplante en macetas de 0.15 L de capacidad (6.5 x 5.6 x 5.6 cm). Como sustrato se usó una mezcla esterilizada en autoclave (Marca Sumi) a una temperatura de 120 °C y 1.5 libras de presión compuesta de arena + peat moss+agrolita en relación 3:2:1.

Resultados y discusión

Estabilidad del cultivo in vitro. Aunque en el Anova existieron diferencias significativas (F= 60.31, p= 0.0001) entre evaluaciones, los parámetros estadísticos referentes a un alto coeficiente de determinación (R²) de 0.72, menor coeficiente de variación (CV) de 26.4 y diferencia mínima significativa (DMS) de 0.44 mostraron que los segmentos intermedios del tallo (SIT) usados como explante pueden expresar una respuesta morfogenética bajo la influencia de los tratamientos.

En condiciones in vitro, se pueden obtener de 1 hasta 22 brotes por explante, siendo los subcultivos III y IV donde en promedio se obtuvo un Nb de 9.22 ±1 brotes por explante (Figura 2a). Aunque existieron diferencias entre el primer y último de los cinco subcultivos, los resultados fueron relevantes para un sistema de producción masivo, el cual puede mantenerse por más de tres años y disminuir su producción a partir de la quinta multiplicación clonal, cuestión que debe ser considerada en la programación de la producción a escala comercial.

En altura de brotes (Ab) también se encontraron diferencias significativas entre evaluaciones (F= 427.45, p= 0.0001), registrando un coeficiente de determinación (R²) de 0.50, un coeficiente de variación (CV) de 32.65 y una diferencia mínima significativa (DMS) de 0.25. En condiciones in vitro la Ab va de 1 hasta 18 mm, siendo los subcultivos III y IV donde en promedio se obtuvo una Ab de 7.56 ±1 mm; sin embargo, el tamaño de los brotes obtenidos en todas las evaluaciones realizadas pudo manipularse por el operador al realizar el subcultivo (Figura 2a).

Figura 2 Número de brotes por explante (Nb) y altura de brote (Ab) en la multiplicación in vitro de la biznaga de ornato ‘cono invertido de Viereck’ (Turbinicarpus viereckii subsp. major (Glass & R. A. Foster) Glass). a) influencia de la estabilidad del subcultivo in vitro; b) influencia del tipo de citocininas; c) influencia del tipo de auxinas; y d) influencia de la concentración. 

Los resultados registrados en cada una de las evaluaciones realizadas mostraron que los explantes SIT son estables en el cultivo in vitro siendo un tejido vegetal organizado con yemas axilares, a partir del cual se puede regenerar la biznaga ‘cono invertido de Viereck’ T. viereckii subsp. major.

Influencia del tipo de citocininas. Al analizar el total de los subcultivos el Anova no muestra diferencias significativas (p≤ 0.05) entre las citocininas evaluadas en Nb; sin embargo, con el medio de cultivo MS al 50% con KIN se obtuvo la mayor respuesta, registrando en promedio en Nb con 8.69 brotes por explante (Figura 2b).

La tasa de multiplicación para la biznaga T. viereckii subsp. major con ambas citocininas supera a la obtenida en M. craigii (4.65), M. formosa (4.42), M. obscura (4.78) y M. uncinata (5.25) (^{Pérez-Molphe-Balch et al., 1998}), M. oteroi (5.3) (^{Castro-Gallo et al., 2002}) y es similar con la reportada para biznaga ‘cono invertido de Knuth’ (Turbinicarpus knuthianus (Boed.) John y Říha (^{Villavicencio et al., 2011}). En Ab si se registró una diferencia estadística significativa (p≤ 0.05) entre citocininas, donde la BAP es la fitohormona que influye en esta variable con un Ab de 6.27 mm superando en tamaño a los brotes obtenidos con KIN (Figura 2b).

En otras especies de cactáceas como Epithelantha micromeris var. micromeris, Strombocactus disciformis, y T. schmiedickeanus var. klinkerianus (^{Soltero y Portillo, 2015}) y T. knuthianus (^{Villavicencio et al., 2011}) también se ha usado la KIN para el cultivo in vitro, al igual que en otras ornamentales, como orquídeas Laeliocattleya (Orchidaceae) (^{Gonçalves et al., 2016}) y café (Coffe arabiga) (^{Cantos-Cevallos et al., 2018}), mostrando que la respuesta mofogenética depende de la citocinina utilizada y del genotipo. La KIN es de origen natural derivada de purinas o adeninas y tiene la capacidad de producir un efecto en la división celular e inducir una respuesta morfogénica en el explante, activando las yemas axilares o meristemos areolares que inducen a la formación de brotes de la biznaga T. viereckii subsp. major como también ha ocurrido en Mammillaria schiedeana schiedeana (^{Soria-Campos et al., 2013}).

Influencia del tipo de auxinas. Existieron diferencias significativas (p≤ 0.05) entre las auxinas evaluadas, siendo el ácido indolbutírico (AIB) el que influyó en la respuesta morfogenética tanto en el Nb como en Ab.

Con esta auxina se obtuvo mayor respuesta en Nb registrando en promedio 8.92 brotes por explante, con una Ab de 6.20 mm superando el efecto generado con el ácido naftalenacético (ANA), en donde ambas variables registraron menor promedio, con un Nb de 7.3 brotes por explante y una Ab de 4.5 mm) (Figura 2c).

El AIB también se ha utilizado para la inducción de brotes de Epithelantha micromeris var. micromeris, donde se han obtenido hasta 13 brotes por explante (^{Villavicencio et al., 2012}), mientras que el uso del ANA ha tenido efecto en otras cactáceas del género Mammillaria spp. (^{Pérez-Molphe-Balch et al., 1998}; ^{Castro-Gallo et al., 2002}; ^{Giusti et al., 2002}; ^{Ramírez-Malagón et al., 2007}; ^{Soria-Campos et al., 2013}) registrando una altura semejante a la reportada en este trabajo.

El mayor número de brotes con menor tamaño es un efecto que ocurre con frecuencia en la micropropagación, como lo refieren ^{Mata-Rosas et al. (2001)}; ^{Pérez-Molphe-Balch, et al. (2015)}, por lo que siempre es adecuado evaluar varias combinaciones de citocinina-auxina para determinar el equilibrio entre las variables de respuesta que se buscan en la etapa de multiplicación in vitro de la especie de interés. Esto para asegurar una propagación intensiva, dar continuidad a la etapa de multiplicación y garantizar la supervivencia durante la aclimatización.

Influencia de la concentración. Independientemente del tipo de citocinina utilizada, existieron diferencias altamente significativas entre concentraciones (p≤ 0.01). Las concentraciones de 2.5 y 5 mg L^-1 fueron estadísticamente iguales, superando al resto de las concentraciones evaluadas, con un Nb de 8.99 brotes/explante y una Ab de 6.24 mm (Figura 2d).

Influencia del tipo de concentración y citocinina. El medio base MS al 50% adicionado con 2.5 mg L^-1 de KIN y 5 mg L^-1 de BAP, fueron estadísticamente iguales, superando al resto de las concentraciones evaluadas. Ambas citocininas y concentraciones promovieron la inducción de brotes con un Nb de 9.19 y 9.09 brotes por explante, respectivamente (Cuadro 1).

La diferencia entre ambas concentraciones y tipo de citocininas radicó en la altura de brotes, donde la mayor respuesta se obtuvo con 5 mg L^-1 de BAP registrando una Ab de 6.55 mm. Estos resultados mostraron que los SIT fueron más compatibles con KIN, una fitohormona natural, donde a menor concentración en el tejido vegetal se generó mayor respuesta en la inducción de brotes, a diferencia de los SIT que fueron expuestos con BAP, que es una citocinina sintética donde la mayor inducción de brotes se obtuvo al duplicar la concentración (Cuadro 1).

El efecto del tipo de citocinina y concentración en el número y altura de brotes también se ha reportado en biznagas de tipo globoso, en donde se han aplicado de 3 hasta 10 mg L^-1 de KIN (^{Soltero y Portillo, 2015}) y de 0.5 hasta 2 mg L^-1 cuando se ha utilizado BAP (^{Soria-Campos et al., 2013}).

Los resultados muestran que el control hormonal influye en la diferenciación del explante, como lo refieren ^{Pérez-Molphe-Balch y Dávila-Figueroa (2002)}; ^{Dávila et al. (2005)}; ^{Ascough y Van Staden (2010)} ; ^{De la Rosa-Carrillo et al. (2012)}. Este control tuvo un efecto positivo en el cultivo in vitro logrando que la conservación ex situ sea factible tanto para la cactácea en estudio T. viereckii subsp. major, como para otras especies, como el viejito Cephalocereus senilis (Haw.) Pfeiff. (^{Choreño et al., 2002}), pitaya Stenocereus stellatus (Pfeiff.) Riccob. (^{Martínez-Villegas et al., 2011}), mamilaria Mammillaria voburnensis Scheer (^{Ordoñez, 2003}), cactus alcachofa Obregonia denegrii Frič & A. Berger (^{Cardarelli et al., 2010}) y minicactus Turbinicarpus spp.

Influencia de los tratamientos. Al realizar la prueba de medias de Tukey (p≤ 0.05) a los tratamientos como efectos independientes, tomando en consideración la interacción entre el tipo de citocinina y auxina con sus diferentes concentraciones evaluadas, se determinó que existen dos tratamientos que pueden ser utilizados en la etapa de multiplicación. El medio MS al 50% adicionado con 5 mg L^-1 de BAP + 0.5 mg L^-1 de AIB y el adicionado con 2.5 mg L^-1 de KIN + 0.25 mg L^-1 de AIB fueron estadísticamente igual superando en Nb al resto de los tratamientos evaluados, registrando un Nb de hasta 9.25 brotes por explante; sin embargo, con el segundo tratamiento se obtienen brotes con mayor tamaño, con una Ab de 6.73 mm, lo que facilita una mejor manipulación de estos al realizar el subcultivo (Cuadro 2).

Estos resultados muestran que la interacción citocinina:auxina en relación 10:1 influye en la morfogénesis del explante de esta especie, regulando la división y crecimiento celular de las yemas axilares para la inducción de brotes (Figura 3).

Figura 3 Multiplicación de la biznaga de ornato ‘cono invertido de Viereck’ (Turbinicarpus viereckii subsp. major (Glass & R. A. Foster) Glass). a, b y c) inducción de brotes; d) vitroplantas; y e) plantas aclimatadas. 

La interacción KIN:AIB es similar a la reportada por ^{Finti et al. (2012)}; Pacheco (2015); ^{Velázquez y Soltero (2001)}; ^{Villavicencio et al. (2020)}, quienes encontraron que la fuente de citocinina tiene efectos significativos sobre la producción de brotes en la biznaga ‘nido de golondrina’ Epithelantha micromeris var. micromeris (Engelm.) F. A. C. Weber ex Britton & Rose, nopal Opuntia ficus-indica (L.) Mill. y ‘sacasil’ Echinocereus poselgeri Lem. por lo que seconsidera este aspecto en la micropropagación de cactáceas, dado que la eficiencia del tratamiento para la inducción de brotes, como el coeficiente de brotación, son importantes en la etapa de multiplicación in vitro para alcanzar los resultados finales en la micropropagación, de esta etapa dependerá la cantidad de explantes que se establezcan, número de brotes que se generen y vitroplantas que se produzcan.

Al aumentar la concentración en la interacción BAP:AIB y KIN:AIB la tasa de multiplicación disminuye. La menor respuesta morfogenética en las diferentes concentraciones evaluadas se obtuvo con las interacciones BAP:ANA y KIN:ANA.

Esta respuesta indica que el ácido naftalenacético (ANA) es una auxina que estimuló escasamente el crecimiento en las yemas axilares de los explantes de T. viereckii subsp. major. En otras especies, como Mimosa pudica (^{Bianchetti et al., 2017}) la asociación BAP:ANA también registró una baja inducción de brotes, como el efecto reportado en la presente investigación.

En cactáceas como Turbinicarpus pseudomacrochele y Strombocactus disciformis,^{Soltero y Portillo (2015)} refieren que la interacción KIN:ANA puede presentar un efecto significativo cuando se aplica en concentración de 3 a 10 mg L^-1 de KIN, combinada con una baja concentración 0.02 mg L^-1 de ANA, por lo que es necesario considerar dichos factores en este proceso, ya que la respuesta morfogenética del explante dependerá significativamente de ésta interacción y del resto de los componentes del medio de cultivo.

Conclusiones

La regeneración de esta especie en estatus de riesgo, así como su conservación ex situ puede realizarse con la multiplicación in vitro, donde la relación citocinina-auxina influye en la capacidad morfogenética y en la estabilidad del explante, a partir del cual se puede inducir la proliferación de brotes axilares.