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Introducción
En la actualidad existe un gran interés por la búsqueda de ingredientes que brinden beneficios a la salud, como los alimentos funcionales (Robertfroid, 2000). Entre ellos, los de origen vegetal tienen un amplio contenido de nutrientes y componentes fitoquímicos con una variedad de estructuras químicas con diferentes efectos fisiológicos en el organismo humano. Estudios epidemiológicos refieren una asociación entre el consumo de frutas, vegetales y granos y la prevención del riesgo de enfermedades crónico-degenerativas (Ferrari et al., 2003; Ilow et al., 2008). En este contexto, se sabe que los fenoles son compuestos que por sus propiedades antioxidantes son considerados como preventivos de enfermedades relacionadas con el desbalance del sistema oxidativo, asimismo son capaces de destruir células cancerígenas (Scarpa y Ninfali, 2015).
Por otra parte, las especies del género Physalis, de la familia de las solanáceas, son de gran importancia económica y cultural; y se cultivan principalmente por sus características alimenticias, como el tomate verde (Physalis philadelphica Lam.) que fue domesticado en México y llevado a Europa y a otras partes del mundo (Zamora et al., 2015); hallazgos arqueológicos han confirmado que su uso en la dieta de la población mexicana se remonta a la época precolombina. Diferentes partes de la planta (hojas, raíz, cáliz, y frutos) de varias especies se utilizan en la medicina tradicional así como en el rubro industrial, ornamental y forrajero (Santiaguillo y Blas, 2009). A pesar de esto, pocas especies han sido cultivadas, entre ellas P. ixocarpa Brot. ex Horm., P. peruviana L. y P. alkekengi L.
Muchas especies de Physalis emergen dentro de cultivos establecidos, y han desarrollado características de adaptación y resistencia a condiciones adversas, por lo que prosperan como ruderales o arvenses; así, se recolectan para la alimentación familiar y en la economía a través de la venta de sus frutos (Santiaguillo et al., 2000).
En estudios fitoquímicos se ha identificado la presencia de witaesteroides (fisalinas) como metabolito secundario propio del género (Ray y Grupta,1994; Pérez-Castorena et al., 2004), así como flavonoles y diversos ácidos fenólicos con propiedades antioxidantes (Medina-Medrano et al., 2015).
Se han consignado 66 especies silvestres de Physalis en México, de las cuales 37 son endémicas. Además, se considera a este país como el centro de diversidad del género (Martínez, 2017), que posee un gran potencial fitoquímico y propiedades medicinales. Destaca P. chenopodifolia por su uso etnobotánico, es un taxon semi-cultivado y su aprovechamiento se destina a diversos fines (Santiaguillo y Blas, 2009).
Así, esta especie concentra un alto contenido de minerales, especialmente hierro en hojas de plantas silvestres (243.5 mg kg-1) y cultivadas (272.27 mg kg-1); en un tamizaje fitoquímico, Salcedo-Pérez et al. (2015) registraron la presencia de terpenos/esteroides y fenoles, en particular en hojas y tallos de plantas silvestres y cultivadas.
Con base en todo lo anterior, se planteó el siguiente objetivo que consistió en evaluar la composición fenólica y actividad antioxidante en hojas y frutos de plantas silvestres y bajo cultivo de Physalis chenopodifolia.
Materiales y Métodos
Se recolectaron plantas de P. chenopodifolia en un bosque de encino del predio San Nicolás de los Ranchos, municipio Cholula, en el estado de Puebla en noviembre de 2015. Los ejemplares fueron depositados en el Herbario del Instituto de Botánica de la Universidad de Guadalajara (IBUG) y registrados con el número de ingreso 1 469.
Se separaron semillas maduras de dichas plantas, que fueron cultivadas en un campo experimental del Centro Universitario de Ciencias Biológico y Agropecuarias (CUCBA) de la Universidad de Guadalajara. Las semillas se sembraron en surcos con acolchado plástico y cintillas de riego por goteo. Se les incorporó fertilizante NPK (30:30:30) en la etapa vegetativa y otra en la etapa reproductiva (15:45:25); además, se aplicó insecticida sistémico para mosca blanca principalmente, y se realizaron deshierbes de forma manual (Valdivia-Mares, 2016). El cultivo se realizó de enero a julio del 2016.
Material experimental
Se deshidrataron las hojas y los frutos completos de las plantas silvestres y cultivadas a 45 ºC durante 48 h, en una estufa de aire forzado (Novatech HS35-EA) y se molieron a un tamaño de partícula de 0.5 mm de diámetro. Con 0.5 g de cada muestra de hojas y frutos por separado, se preparó una mezcla con 50 mL de metanol/agua (80/20) en un baño ultrasónico Branson B-200 por 20 min; del extracto, se separaron 2 mL, porción que se filtró y centrifugó a 14 000 rpm durante 5 min en una centrífuga Labogen MINI (Atanassova et al., 2011).
Determinación de fenoles y flavonoides totales
El contenido de fenoles totales se determinó con el método de Folin-Cilocalteu. Un mL de cada extracto por triplicado se mezcló con 9 mL de agua grado HPLC y un mL del reactivo Folin-Ciocalteu. Después de 5 min se le adicionaron 10 mL de carbonato de sodio (Na2CO3) al 7 % (p/v) y al final la mezcla se aforó a 25 mL con agua grado HPLC. Se incubaron en la oscuridad por 90 min a temperatura ambiente y se leyó la absorbancia a 750 nm en un espectrofotómetro JENWAY modelo 6320D. Se utilizaron diferentes concentraciones de ácido gálico (0, 20, 40, 60, 80 y 100 mg L-1) como estándar para calcular el contenido de fenoles totales, expresados como mg de equivalentes de ácido gálico (EAG) 100-1 g de muestra en peso seco (mg EAG/100 g-1 PS) (Atanassova et al., 2011).
El contenido total de flavonoides totales se analizó por el método de cloruro de aluminio (AlCl3), para lo cual se tomó una alícuota por triplicado de un mL del extracto y se mezcló con 4 mL de agua destilada y 0.3 mL de NaNO2 al 5 % (p/v); pasados 5 min, se adicionaron 0.3 mL de AlCl3 al 10% y seis minutos después, 2 mL de una solución de hidróxido de sodio (NaOH) al 1M y se complementó hasta un volumen total de 10 mL con agua. Se mezcló en un agitador vortex OHAUS OHS-30392115) y se leyó la absorbancia a 510 nm en un espectrofotómetro JENWAY modelo 6320D. Se utilizaron diferentes concentraciones de (+) catequina (0, 20, 40, 60, 80 y 100 mg L-1) para la realización de una curva estándar para calcular el contenido de flavonoides totales expresado como mg equivalentes de catequina por 100-1 g de peso seco (mg EC 100 g-1 PS) (Atanassova et al., 2011).
Determinación de la capacidad antioxidante
La actividad antioxidante fue evaluada usando dos diferentes métodos. La actividad de inhibición del radicales libres con DPPH, de acuerdo con Atanassova et al. (2011) usando DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazilo), 0.004 % (en metanol, p/v), los extractos (n=3) se diluyeron a diferentes concentraciones (100, 200 y 500 μL mL-1) y se mezclaron con 4 mL del DPPH, en la oscuridad. Después de 60 min de incubación en la oscuridad y a temperatura ambiente, se leyó la absorbancia contra un blanco (solo reactivos sin muestra con metanol) a 517 nm en un espectrofotómetro UV-VIS JENWAY 6320D. La actividad antioxidante se expresó como porcentaje (%) de inhibición de radicales libres por DPPH, de acuerdo a la siguiente ecuación:
La evaluación de la capacidad de donación de átomos de hidrogeno se determinó mediante el método ORAC (Ou et al., 2001) con algunas modificaciones. Es una de las técnicas más aceptadas para la medición de la capacidad antioxidante, pues mide la inhibición de la oxidación inducida por radicales peróxido, generados por la descomposición térmica del 2,2'-azobis (2-amidinopropano) dihidrocloruro (AAPH), el cual reacciona con una sonda fluorescente (fluoresceína), para formar un producto incoloro no fluorescente. Se diseñó una curva de calibración de Trolox como estándar de referencia en concentraciones de 0.02 a 3 μM de Trolox (μM ETx mL-1). La actividad antioxidante se calculó a partir de la ecuación:
Obtenida de la curva de calibración de Trolox.
El ensayo se llevó a cabo en un lector de microplacas de 96 pozos (Fluorómetro Tecan infinite M200PRO) en donde se colocaron 20 μL de los extractos o del estándar (Trololox 5 mM), se les adicionó 120 μL de fluorescina (120 nM) y AAPH (2,2-azobis (2-metilpropionamidina) dihidrocloruro) 40mM, se incubaron en una estufa (Novatech HS35-EA) a 37 ºC durante 30 min y se registraron las lecturas con λ de excitación 485 nm y λ de emisión 538 nm respectivamente con 70 ciclos cada 5 minutos. El efecto protector del antioxidante fue calculado usando las diferencias de áreas bajo la curva de decaimiento de la fluoresceína entre el blanco y la muestra. El área bajo la curva (AUC) se calculó como sigue:
Donde:
f 0 = Lectura de la fluorescencia inicial al minuto 0
f 1 = Lectura de la fluorescencia al tiempo i
El AUC neta se obtuvo de sustraer el AUC del blanco del AUC de la muestra:
Los resultados se expresan en μM de equivalentes de Trolox en 100 g de peso seco (μM ETx 100 g-1 PS).
Resultados
Contenido de fenoles y flavonoides totales
En el Cuadro 1 se puede observar que las plantas silvestres presentaron mayor contenido de compuestos fenólicos (196.46 (0.02 mg EAG 100 g-1 de PS) tanto en hojas como en frutos, en comparación con las cultivadas (23.58 (0.12 EAG 100 g-1 de PS). En los frutos los valores obtenidos fueron de 9.44 en plantas silvestres y de 6.21 en las cultivadas. Lo mismo sucede con los polifenoles totales; los flavonoides se obtuvieron en mayor cantidad en las hojas y frutos de plantas silvestres (148.52 (0.1 y de 23.1 ± 0.01 mg EC 100 g-1 de PS, respectivamente) que en las cultivadas (6.01 y 3.79 respectivamente) (Cuadro 1).
Cuadro 1 Contenido de polifenoles y flavonoides totales en hojas y frutos de plantas silvestres y cultivadas de Physalis chenopodifolia Lam.
| Polifenoles totales (mg EAG 100 g-1 PS) |
Flavonoides (mg EC 100 g1 PS) |
|
|---|---|---|
| Plantas silvestres | ||
| Hojas | 196.46 (0.2 | 148.52 (0.1 |
| Fruto | 9.44 (0.01 | 23.10 (0.01 |
| Plantas bajo cultivo | ||
| Hojas | 23.58 (0.12 | 6.01 (0.03 |
| Frutos | 6.21 (0.03 | 3.79 (0.02 |
Actividad antioxidante por DPPH
Por este método se observó un mayor porcentaje de bloqueamiento de radicales libres en hojas de plantas cultivadas que en plantas silvestre, a pesar de que el contenido de polifenoles y flavonoides fue mayor en hojas de las segundas (Cuadro 2). La actividad antioxidante se incrementó con el aumento de las concentraciones, tanto en hojas como en frutos. El valor más alto correspondió a la concentración de 500 μL mL-1 con 11.5± 0.4 % y de 8.28 ( 0.3 %, para plantas cultivadas y silvestres, respectivamente. Las demás concentraciones (200 y 100 μL mL-1) fueron de 6.45 ( 0.3 y de 4.19 ( 0.2 para las plantas cultivadas y de 3.91 ( 0.1 y 2.14 ( 0.1 en plantas silvestres.
Cuadro 2 Captación de radicales libres (%) con DPPH en hojas de plantas silvestres y bajo cultivo de Physalis chenopodifolia Lam.
| Concentración (μL mL-1) | Plantas silvestres | Plantas cultivadas |
|---|---|---|
| 500 | 8.28 ± 0.3 | 11.50 ± 0.4 |
| 200 | 3.91 ± 0.1 | 6.45 ± 0.3 |
| 100 | 2.14 ± 0.1 | 4.19 ± 0.2 |
En los frutos, los porcentajes de bloqueamiento de radicales libres fueron similares en ambos tipos de plantas (Cuadro 3), y, al igual que en las hojas, a mayor concentración de las muestras se incrementó la actividad antioxidante; a 500 μL mL-1 se registraron las más altas de 61.78 ± 1.2 y 62.69 ± 1.5 %, respectivamente; en 200 μL mL-1 fueron de 20.7 ± 0.9 y 17.42 ± 0.6, y a 100 (μL mL-1), las más bajas con 9.86 ± 0.4 y 8.22 ± 0.3 %.
Actividad antioxidante con el ensayo ORAC-Fluoresceína (ORAC-FL)
Los valores más altos se encontraron en hojas y frutos de las plantas silvestres de 1 396 ± 15.5 y 342 ± 10 μM ETx 100 g-1, respectivamente, en comparación con las de plantas bajog cultivo (156 ± 5 y 297 ± 8 μM ETx 100 g-1 para hojas y frutos, respectivamente (Figura 1).
Discusión
Fenoles y flavonoides
Los valores de fenoles totales en las hojas de las plantas silvestres de Physalis chenopodifolia (196.46 mg de EAG 100 g-1 PS) son superiores a los de las hojas de especies usadas como medicinales en Polonia (0.15 a 15.15 mg de EAG 100 g-1 PS) (Wojdylo et al., 2007); de Bulgaria, con valores de 27.94 a 48.9 mg de EAG 100 g-1 PS (Attanasova et al., 2011), y de algunas plantas de la medicina tradicional China como Pinellia ternata (Thunb.) Makino, con 12 mg de EAG 100 g-1 PS, hasta 166 mg de EAG 100 g-1 PS en Trichosanthes kirilowii Maxim (Song et al., 2010), con el mismo ensayo de Folin-Ciocalteu y ácido gálico como estándar. Así mismo, de verduras comestibles, consideradas como fuentes importantes de fenoles como espárragos, col, zanahoria, apio, calabaza, ajo, lechuga, cebolla, rábano, espinaca, chile, jitomate y betabel con valores entre 13.5 a 154.1 mg 100 g-1 PS (Ninfali et al., 2005).
Sin embargo, son inferiores a otras plantas medicinales comerciales referidas por Yoo et al. (2008), con valores de 464.2 a 844.4 mg 100 g-1 PS y por Pourmorand et al. (2006) en plantas medicinales de Irán con 3100 a 28950 mg 100 g-1, así como de algunas otras populares en Serbia de uso etnobotánico terapéutico en enfermedades como diabetes, reumatismo, vías urinarias, ulceraciones, hipertensión, arterioesclerosis, por ejemplo, con valores de 960 a 6 200 mg de EAG 100 g-1 (Žugić et al., 2014).
En comparación con otras solanáceas, la especie en estudio presenta un contenido inferior a Solanum madrense Fernald, como lo describen Fernández y Ruiz (2017) que alcanzó valores en hojas de 202 a 377 mg EAG 100 g-1. En otras especies de Physalis, como P. patula Mill, P. subulata L., P. solanacea L. y P. hederifolia A. Gray var. hederifolia, Medina-Medrano et al. (2015) estimaron un contenido en hojas de 58.75 a 1 290.06 mg EAG g-1 y establecieron que los más comunes son los ácidos fenólicos, la quercetina y el kaempferol glucosilado, determinados mediante cromatografía de alta presión (HPLC).
Los polifenoles de los frutos de Physalis chenopodifolia son similares a frutas comerciales como Musa cavendish L. (7 mg EAG 100 g-1 (Singh et al., 2016) pero inferiores a frutos de mango (78.3), guayaba (87.5), papaya (88.2) y dátiles (304.24 a 563.71) (Amira et al., 2012; Patthamakanokporn et al., 2008;), así como a frutos de Ecuador de 25 a 2 167) y de Physalis peruviana de diferentes localidades de Perú (106 a 149.3 mg EAG 100 g-1) (Jurado et al., 2016; Vasco et al., 2008).
El contenido de flavonoides en las hojas de la especie de interés fue superior a los de hojas de especias y plantas medicinales según lo refieren Ninfali et al. (2005), Žugić et al. (2014) y Attanasova et al. (2011). Así mismo, las cifras del presente estudio son superiores a las correspondientes a verduras comestibles (7.0 a 89.1 mg EC 100 g-1) (Ninfali et al., 2005).
Sin embargo, son inferiores a especias y hierbas medicinales según Žugić et al. (2014), Ninfalli et al. (2005) y Yoo et al. (2008), cuyos valores se distribuyen entre 600 y 1 321.2 mg EC 100 g-1. Los mismo es extensivo para otras solanáceas como Solanum madrense (389 a 531 mg EC 100 g-1) (Fernández y Ruiz, 2017) y de otras especies mexicanas de Physalis, con valores en hojas de 6.543 a 21.265 mg de EC g-1 de muestra (Medina-Medrano et al., 2015).
La actividad antioxidante de hierbas, frutos, suplementos alimenticios y bebidas por lo regular es analizada con ensayos in vitro y generalmente en relación con el contenido de polifenoles mediante métodos tradicionales, y solo se aplica una técnica. Los métodos más comunes para medir dicha capacidad son el DPPH y el ORAC, por ser muy fáciles de reproducir, pero también muestran diferencias significativas en su respuesta a los antioxidantes (Roy et al., 2010).
Actividad antioxidante, DPPH
Por lo general, las muestras con mayor contenido de polifenoles o flavonoides presentan mayor actividad antioxidante (Žugić et al., 2014), lo que no se reflejó en las muestras del presente estudio; sin embargo, se han reportado otros compuestos con actividad antioxidante, como las fisalinas consideradas como el principal metabolito en este género. Hernández (2015) refiere actividad antioxidante con DPPH en hojas de Physalis peruviana, por lo que sería interesante evaluar el contenido de fisalinas en estas muestras.
Los valores obtenidos en las hojas son superiores a otras solanáceas como Solanum ferrugineum Jacq., sobre la que se calcula 10 % a una concentración más alta (1 000 μL mL-1) (Medina-Medrano et al., 2016). Pero menores a las de hojas de hierbas comerciales y medicinales como Eucalyptus globulus Labill. y Chamaemelum nobilis L. con valores de 60.1 y 91 % a una concentración de 100 μL mL -1 analizadas también con DPPH (Yoo et al., 2008). En hojas de Solanum madrense,Fernández y Ruiz (2017) estimaron 90 % a 500 μL -1 mL, por medio de DPPH.
A 500 μL mL-1 en las muestras de los frutos estudiados, los números son superiores a los registrados en otras solanáceas como Solanum ferrugineum (con 15 % a concentración de 1 000 μg mL-1) (Medina-Medrano et al., 2016) y Physalis peruviana (42.22 % a 800μg mL-1) (Jurado et al., 2016).
Actividad antioxidante, ORAC-Fluoresceína
A diferencia de lo obtenido con la técnica del DPPH, las hojas de plantas cultivadas mostraron mayor capacidad antioxidante; esto se puede explicar por el contenido de polifenoles totales y flavonoides, ya que hay evidencias significativas de que los valores de ORAC son estrictamente dependientes del contenido de fenoles y flavonoides; además, mientras las técnicas ORAC miden la capacidad de disminuir radicales oxigeno inducida por radicales peróxido, la DPPH cuantifica el porcentaje de captación de radicales libres en general (Ninfali et al., 2005).
Por otra parte, los valores de ORAC de las hojas de plantas silvestres de Physalis chenopodifolia son más altos que los de algunas plantas medicinales como Petroselium hortensis L. (13 018 μmol ET 100 g-1) y Rosmarinus officinalis L. (29 032 μmol ET 100 g-1). Así como de algunos vegetales comestibles como chile, jitomate, calabaza cebolla, zanahoria, lechuga y rábano con valores de 252 a 1 240 μmol ET 100 g-1 (Ninfali et al., 2005), pero inferiores a otras medicinales también según Ninfali et al., 2005) con valores que alcanzan más de 32 000 μmol ET 100 g-1.
Conclusiones
El vasto mundo de las plantas medicinales, con miles de especies y variedades, demanda mucha investigación científica, especialmente en su contenido de compuestos fenólicos y actividad antioxidante, en ejemplares silvestres y cultivados.
El presente estudio muestra, por primera vez, el contenido de fenoles, flavonoides y capacidad antioxidante en hojas y frutos de Physalis chenopodifolia silvestre y bajo cultivo, utilizada empíricamente como medicinal y que ya es semi-cultivada. Se observaron diferentes resultados en la actividad antioxidante con DPPH y ORAC, éste último mostró valores más dependientes del contenido de fenoles para nuestra muestra. Por ello sería importante identificar y cuantificar los polifenoles individuales por técnicas más específicas como HPLC ya que se sabe que existe una relación entre el tipo de polifenoles y su actividad antioxidante. Los resultados aquí consignados indican que el ensayo por ORAC refleja mejor la actividad antioxidante para la especie en estudio. Las hojas de las plantas silvestres mostraron el mayor contenido de polifenoles y flavonoides, así como mayor capacidad antioxidante por el método ORAC, lo que significa que éstas podrían representar una fuente potencial de compuestos para desarrollar nuevos medicamentos en la salud humana.
