Identificación de hongos antagonistas a Phytophthora cinnamomi Rands en bosques de encino de el Arrayanal, Colima y Tecoanapa, Guerrero

 

Identification of fungi potentially antagonist to Phytophthora cinnamomi Rands in oak forest at the el Arrayanal, Colima and Tecoanapa, Guerrero

 

Alejandra Almaraz-Sánchez*; Dionicio Alvarado-Rosales¹; Bertha Tlapal-Bolaños²; David Espinoza-Victoria³

 

¹ Programa de Fitopatología, Colegio de Postgraduados. km 36.5, Carretera México-Texcoco. C. P. 56230. Montecillo, Texcoco, Estado de México. Correo-e: alejandraas@colpos.mx (*Autor para correspondencia).

² Departamento de Parasitología Agrícola, Universidad Autónoma Chapingo. km 38.5, Carretera México-Texcoco. C. P. 56230. Chapingo, Texcoco, Estado de México.

³ Programa de Edafología, Colegio de Postgraduados. km 36.5, Carretera México-Texcoco. C. P. 56230. Montecillo, Texcoco, Estado de México.

 

Recibido: 05 de septiembre de 2011
Aceptado: 14 de julio de 2012

 

RESUMEN

El objetivo del presente estudio fue identificar morfológica y molecularmente la micoflora que posee propiedades antagonistas sobre Phytophthora cinnamomi, asociada al suelo del bosque de encino (Quercus spp.) de El Arrayanal, Colima, y de Tecoanapa, Guerrero. En estas localidades se realizaron dos muestreos de suelo colectándose muestras compuestas de suelo-raíz alrededor de los árboles con diferentes edades y condiciones sanitarias en rodales afectados por P. cinnamomi. Los hongos se identificaron morfológicamente mediante la técnica de dilución de suelo PDA-TS (papa-dextrosa-agar-tergitol-estreptomicina). Con los aislamientos obtenidos se realizaron pruebas de antagonismo in vitro. Los aislamientos de Trichoderma, Cordyceps bassiana y Paecilomyces son los que ejercieron mejor biocontrol al reducir el desarrollo de P. cinnamomi mostrando mecanismos sobresalientes de competencia por espacio y micoparasitismo. Los hongos se caracterizaron molecularmente amplificando la región intergénica (ITS) de los genes ribosomales mediante la técnica de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se reportan por vez primera a C. bassiana, Cladospo-rium tenuissimun y seis especies de Trichoderma asociadas al bosque de encino en México.

Palabras Clave: ITS-rDNA, suelo, antagonismo, Quercus.

 

ABSTRACT

The aim of this study was to identify morphologically and molecularly the mycoflora that possesses antagonistic properties on Phytophthora cinnamomi associated to the oak (Quercus spp.) soil forest at El Arrayanal, Colima, and Tecoanapa, Guerrero. Two soil samplings were done in these sites. Soil -root samples around trees with different ages and health conditions in stands affected by P. cinnamo-mi were collected. The fungi were morphologically identified by soil dilution PDA-TS (potato-dextrose-agar-tergitol-streptomycin) technique. With the obtained isolates, in vitro antagonism tests were done. Trichoderma spp, Cordyceps bassiana and Paecilomyces isolates, showed the best biological control by reducing P. cinnamomi development and showing outstanding mechanisms of space competition and mycoparasitism. The fungi were molecularly characterized by amplifying the intergenic region (ITS) of the ribosomal genes by the amplification of polymerase chain reaction (PCR) technique. For the first time C. bassiana, Cladosporium tenuissimun and six Trichoderma species associated with oak forests in Mexico are reported.

Keywords: ITS- rDNA, soil, antagonism, Quercus

 

INTRODUCCIÓN

El suelo es el medio donde se desarrolla la vida de innumerables formas de organismos que tienen una gran variedad de actividades, y que contribuyen a incrementar la capacidad productiva del mismo. En un solo gramo de tierra podemos encontrar millones de microorganismos benéficos; bacterias, actinomicetos, hongos, algas y proto-zoarios (Alexander, 1980).

La actividad de los hongos en el suelo de los bosques es importante para el funcionamiento de los ciclos biogeoquímicos, particularmente en el ciclo del carbono. El ambiente del suelo contiene factores biológicos, químicos y físicos que ejercen efecto sobre la micoflora (Burges & Raw, 1971). Los hongos son microorganismos activos en el desarrollo de la estructura del suelo; comúnmente el número de hongos por gramo de suelo se ha cuantificado en 8,000 a más de un millón; esto probablemente puede ser equivalente a 1,000 o 1,500 kgha^-1, a 20 cm de profundidad. Aunque la cantidad de bacterias en el suelo es más alta, los hongos son de tamaño superior y presentan una masa mayor de desarrollo por unidad de volumen de suelo (Campbell, Johnson, Philpot, & Warnock, 1996).

Por otra parte, existen grupos importantes de antagonistas que pueden ser aprovechados en el control biológico y que crecen de manera natural en la rizósfera; entre ellos se encuentran las micorrizas, hongos, bacterias y actinomicetos (Álvarez & Ferrera-Cerrato, 1994; Papavizas, 1985). La "enfermedad de la tinta"; ocasionada por Phytophthora cinnamomi Rands, está propiciando el incremento de hectáreas afectadas en áreas boscosas de encino en México (Alvarado-Rosales et al., 2007; Alvarado-Rosales, Saave-dra-Romero, & Almaraz-Sánchez, 2008). Sin embargo, el control de la enfermedad no puede ser realizado a través de productos químicos debido al costo que implican y al tipo de cultivo, por lo que una opción es el uso de biocon-troladores nativos. Por tal motivo, el objetivo del presente estudio fue identificar morfológica y molecularmente la mi-coflora que posee propiedades antagonistas sobre P. cin-namomi, asociada al suelo del bosque de encino (Quercus spp.) de El Arrayanal, Colima, y de Tecoanapa, Guerrero.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Descripción de las áreas de estudio

El Arrayanal se encuentra ubicado en el municipio de Minatitlán, en la porción noroeste del estado de Colima, a una distancia aproximada de 20 km en línea recta del sur de Minatitlán y a 45 km al oeste de la ciudad de Colima. El clima se clasifica como A (w0) y BS1 (h"), cálido subhúmedo con lluvias en verano, de menor humedad y semiseco muy cálido. El suelo es de tipo Re-gosol eútrico y dístrico, aunque en pequeñas superficies se pueden presentar Cambisoles crómicos y dístricos (Moreno et al., 2001).

El municipio de Tecoanapa tiene una extensión territorial de 776.9 km² y se ubica en la Costa Chica del estado de Guerrero. El clima es w2, que corresponde a cálido subhúmedo con lluvias en verano (junio a octubre) con una precipitación de 1,300 a 1,500 mm anuales. El municipio se ubica en terrenos con pendientes fuertes a moderadas, con geología de rocas sedimentarias (calizas), predominando los suelos arenosos, delgados y pedregosos (Litosoles, Rendzinas y Regosoles) (Estudio de Reordenamiento Territorial de Xalpatláhuac, 2004).

 

Fase de campo

En cada localidad se seleccionaron sitios de mues-treo de 0.1 ha para determinar la micoflora del suelo. En cada sitio se tomaron cinco muestras compuestas (suelo-raíz) de 1 kg, correspondientes a cinco árboles; uno ubicado en el centro y el resto en los cuatro puntos cardinales. Las muestras se colectaron a una profundidad de 10 cm de la rizósfera del árbol. En El Arrayanal se muestrea-ron once sitios en julio de 2005 y en febrero de 2008. En cada sitio se seleccionaron cinco árboles con diferentes edades y síntomas de la enfermedad, dando un total de 110 árboles e igual número de muestras compuestas. En Tecoanapa, la toma de muestras fue similar; 13 sitios se muestrearon en octubre de 2007 y 12 en enero de 2008, dando un total de 125 muestras y el mismo número de árboles muestreados. Las muestras fueron colocadas en bolsas de plástico, etiquetadas y trasladadas en una hie-lera para su análisis en laboratorio.

 

Fase de laboratorio

Determinación de la micoflora de las muestras del rizoplano

La población de la micoflora presente en el suelo de los sitios se estimó con la técnica de dilución de suelo PDA-TS (Papa-Dextrosa-Agar-Tergitol-Estreptomicina) de Steiner y Watson (1965), usando la dilución 10^-3.

 

Pruebas de antagonismo in vitro

Se realizaron bioensayos contra P. cinnamomi utilizando los aislamientos obtenidos (Cuadro 1) de los géneros Trichoderma, Gliocladium, Paecilomyces y Cladosporium. La evaluación se hizo mediante la observación de los mecanismos de competencia, micoparasitis-mo y antibiosis. Para ello, en cajas Petri con medio de cultivo PDA se sembraron discos (5 mm de diámetro) de micelio activo del patógeno de siete días de edad. Los discos se colocaron en el centro de la caja y se incubaron por 24 h a temperatura ambiente (25 °C) hasta alcanzar 1 cm de diámetro de crecimiento. Alcanzado dicho diámetro, se colocaron tres discos del mismo tamaño del hongo antagonista alrededor de la colonia. El mismo procedimiento, con cinco repeticiones, se realizó para cada uno de los antagonistas y se mantuvieron bajo observación (cada 24 h) durante siete días.

 

Identificación morfológica y molecular de las especies antagónicas

Los aislamientos se cultivaron en PDA e incubaron a 24 °C con luz blanca constante por cinco días. De cada aislamiento se midieron 100 esporas y se observó el tipo de micelio, fiálide y presencia o ausencia de clamidos-poras. La caracterización morfológica de Trichoderma se hizo con ayuda de las claves de Kubicek y Harman (1998). Los Hyphomycetes Gliocladium y Paecelomyces se identificaron con las claves de Domsch, Gams, y Anderson (1980). El hongo Cladosporium fue identificado con las claves de Barnett y Hunter (1998). La especie de Phytophthora se identificó con las claves de Waterhouse (1963) y Erwin y Ribeiro (1996).

La identificación molecular de los aislamientos purificados se hizo mediante la extracción de ADN con la técnica de Ahrens y Seemuller (1992). La calidad del ADN se verificó por electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % y se cuantificó en un espectrofotómetro Per-kin Elmer (modelo Lambda Bio10). Con la técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) se amplificaron las regiones ITS (Internal Transcribed Spacer) utilizando los iniciadores ITS5 (GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG) e ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC), de los genes ARNr (ácido ribonucleico ribosomal), subunidades 18S-5.8S y 5.8S-28S (White, Bruns, Lee, & Taylor, 1990). En cada mezcla de PCR se utilizó un volumen final de 25 µL con la siguiente formulación: 13.22 µL de agua ultrapura estéril, 2.5 µL de solución amortiguadora (TBE 1X), 2.08 µL de MgCl₂ (2.5 mM), 2 µL de dNTPs (2.0 mM), 2 µL de cada uno de los iniciadores ITS5 e ITS4 (20 pmol), 0.2 µL de Taq DNA polimerasa (1.5 U) y 1 µL de ADN (80 ng). La reacción se llevó a cabo en un termociclador Perkin-Elmer (modelo CT 2400) con el siguiente programa: desnaturalización inicial a 95 °C por 2 min; 30 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 1 min, alineación a 50 °C por 30 s, extensión a 72 °C por 2 min; y extensión final a 72 °C por 10 min. El fragmento amplificado se purificó con el KIT Quiagen®. La calidad del fragmento se verificó por medio de electroforesis en gel de agarosa al 1 % y se tiñó con bromuro de etidio. La banda producida se visualizó en un transiluminador (Gel Doc 2000, BIO-RAD^®). El producto de PCR se envió al laboratorio de Macrogen en Estados Unidos para su secuenciación (Automatic Sequencer 3700xl DNA Analyzer, Macroge), en dos direcciones (5' →3' y 3' →5') con los iniciadores ITS5 e ITS4. Las secuencias de estudio se depositaron en el Banco de Genes del Nacional Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) y se compararon de manera individual con las secuencias allí disponibles. De los valores cuantitativos generados, sólo se bajaron las secuencias con valor alto para su comparación con las secuencias de estudio. Las secuencias fueron alineadas con ClustalW versión 1.6.

 

Aislamiento y caracterización molecular de P. cinnamomi

P. cinnamomi fue aislado del suelo de los árboles de bosques de encino en El Arrayanal y Tecoanapa. Los árboles presentaban síntomas ocasionados por el patógeno, como marchitez, muerte regresiva, clorosis, defoliación prematura y presencia de cancros con exudado y tinción de la corteza. Los aislamientos se cultivaron en medio de cultivo selectivo PARPH (pimaricina, ampicili-na, rifampicina, PCNB [pentacloronitrobenceno], himexa-zol). Posteriormente, se cultivaron en PDA e incubaron a 25 °C en oscuridad constante por seis días. De cada aislamiento se midieron 100 esporangios, los cuales se identificaron con las claves de Waterhouse (1963) y Erwin y Ribeiro (1996). La caracterización molecular se realizó con el método de Ahrens y Seemuller (1992).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Hongos aislados de los suelos de El Arrayanal, Colima, y Tecoanapa, Guerrero

En el Cuadro 2 se presentan los aislamientos obtenidos en los sitios de estudio. En El Arrayanal se cuan-tificaron 5,525 aislamientos agrupados en 10 géneros en las dos épocas de muestreo (julio 2005 y febrero 2008). En Tecoanapa se obtuvieron 6,800 aislamientos y se identificaron ocho géneros en los dos periodos de muestreo (octubre 2007 y enero 2008).

En el primer muestreo de El Arrayanal, el número de aislamientos más frecuentes correspondió al género Penicillium, obteniendo 71.46 % respecto del total. En menor porcentaje se identificaron los géneros Aspergillus (12.95 %), Cunningamella (0.79 %), Fusarium (0.36 %), Gliocladium (0.30 %), Mucor (3.16 %), Paecilomyces (5.96 %), Rhizopus (0.42 %) y Trichoderma (4.60 %). En el segundo mues-treo, los aislamientos más frecuentes también fueron del género Penicillium (80.01 %) y en menor porcentaje Glio-cladium (0.51 %), Aspergillus (4.1 %), Cladosporium (1.54 %), Cunningamella (0.77 %), Fusarium (3.86 %), Paeci-lomyces (2.0 %) y Trichoderma (7.21 %).

En Tecoanapa se identificaron ocho géneros en el primer muestreo. La mayoría de los aislamientos correspondieron a Penicillium, el cual representó 67.91 %. En menor porcentaje se obtuvieron Aspergillus (6.5 %), Cla-dosporium (0.54 %), Cunningamella (3.8 %), Fusarium (3.5 %), Mucor (1.1 %), Paecilomyces, (3.8 %) y Tricho-derma (12.85 %). En el segundo muestreo, los géneros obtenidos fueron los mismos, excepto por la ausencia de Cladosporium y la clase Oomycetes. Los porcentajes variaron, pero el género Penicillium fue dominante con 77.67 %. En menor porcentaje se identificaron Aspergillus (6.7 %), Cunningamella (0.32 %), Fusarium (0.64 %), Mucor (1.92 %), Paecilomyces (2.55 %) y Trichoderma (10.2 %).

Con base en los resultados se determinó que el mayor número de géneros se encontró en el mes de julio en El arrayanal y en octubre en Tecoanapa. La dominancia del género Penicillium en ambos suelos se debe a que es un colonizador permanente del suelo y desempeña un papel importante en el desdoblamiento de diferentes sustratos. El comportamiento de Penicillium como saprofito le permite permanecer siempre en el suelo, en comparación con las otras especies de hongos que sólo crecen y se desarrollan en ciertas épocas, principalmente cuando el suelo presenta humedad (Agrios, 2001; Cibrián-Tovar, Alvarado, & García, 2007). La dinámica del resto de los géneros fue diferente en ambos muestreos. Estos resultados concuerdan con lo que se consigna en la literatura. Sharma (1981) reporta que los géneros que predominan en suelos de bosque son Penicillium, Tri-choderma y Fusarium. Lumley, Gignac, y Currah (2001) mencionan que las especies más comunes aisladas de suelo en bosque de Populus y Picea pertenecen a los géneros Trichoderma, Penicillium, Mortierella y Aspergi-llus. Por su parte, Martínez, Valenzuela y Godoy (2005) observaron que los hongos más abundantes en las regiones de Alberta, Canadá, fueron Penicillium, Mortiere-lla y Trichoderma. En general, Penicillium se encuentra en los suelos forestales de México (Cibrián et al., 2007). Kubatova (1996) menciona que este hongo también se puede encontrar en bosques con declinación (encinares y bosques de coníferas) y que puede estar asociado con hongos manchadores (Ophiostoma y Trichoderma).

La familia Moniliaceae, dentro de la cual se encuentran Aspergillus, Fusarium y Penicillium, es causante de pérdidas económicas en almacén, bosques naturales, plantaciones forestales y viveros (Cibrián et al., 2007). Los Oomycetes y Zygomycetes son organismos que se encuentran en todos los ambientes terrestres, y su parasitismo varía desde necrotróficos a biotróficos. En el orden de los Mucorales se encuentran algunos géneros de importancia desde el punto de vista forestal como Rhizo-pus y Mucor. Muchos de éstos son saprofitos y crecen en estiércol, suelo, humus y otros desechos orgánicos (Cibrián et al., 2007). Existen reportes que indican que los géneros Cladosporium, Gliocladium y Paecilomyces, cuyas poblaciones fueron bajas en este estudio, contribuyen a disminuir la cantidad de inóculo de fitopatóge-nos que afectan la raíz (Ahmed, Pérez-Sánchez, Egea & Candela, 1999).

 

Pruebas de antagonismo in vitro

En el Cuadro 3 se reportan los mecanismos de acción de cada uno de los hongos evaluados. Con base en las pruebas de antagonismo, se observó que todos los aislamientos de Trichoderma invadieron las colonias de P. cinnamomi por el mecanismo de competencia, y en algunos casos debido al micoparasitismo ocasionaron lisis. En todas las confrontaciones, los aislamientos de Tricho-derma fueron capaces de reducir el crecimiento y desarrollo del patógeno (Figura 1). La colonización del área compitiendo por espacios y nutrientes es una manera de ejercer biocontrol, al reducir o detener completamente el desarrollo del micelio del patógeno (Dennis & Webster, 1971), lo que permite visualizar que Trichoderma es un buen candidato en el control biológico de P. cinnamomi. Las pruebas in vitro mostraron que existe diferencia significativa (P = 0.05) en el crecimiento de P. cinnamomi en presencia de hongos antagonistas (Figura 2).

Barnet y Binder (1973) mencionan propiedades de antagonismo de los géneros Gliocladium, Cephalos-porium y Trichoderma como micoparásitos de hongos fitopatógenos. Por su parte, Papavizas (1985) también reportó que Trichoderma y Gliocladium constituyen dos agentes de biocontrol, cuya habilidad es actuar como micoparásitos de hongos fitopatógenos del suelo. El género Trichoderma se encuentra distribuido ampliamente en casi todos los suelos, especialmente en aquellos que contienen materia orgánica (Kubicek & Harman, 1998). En general, Trichoderma spp. aumenta la actividad anti-fúngica al presentar una velocidad mayor de crecimiento y, como consecuencia, el tamaño de la colonia de P. cinnamomi se reduce. Estos resultados concuerdan con los de Soler et al. (1998), quienes observaron un efecto claro de antagonismo de Trichoderma contra P. cinna-momi y Rosellinia necatrix, en cultivos duales in vitro. Al respecto, Dennis y Webster (1971) mencionan que el sobrecrecimiento es un carácter ventajoso para la colonización en la competencia por espacio y nutrientes. Los resultados del presente estudio son comparables con los obtenidos por Smith, Wilcox y Harman (1990) en la actividad de Trichoderma contra P. cactorum en manzano, donde también se observó una reducción en el crecimiento del patógeno.

Los hongos Gliocladium y Paecilomyces (Figura 1) inhibieron el crecimiento del patógeno por antibiosis, sin tener contacto con las hifas de P. cinnamomi, ya que se observó una zona libre de crecimiento entre dichos hongos. Esto demuestra que existe producción de metaboli-tos secundarios que pueden estar afectando el crecimiento del patógeno a través de la producción de antibióticos o enzimas, por lo que estos aislamientos son otra alternativa potencial para el biocontrol de P. cinnamomi.

 

Identificación morfológica y molecular de las especies antagonistas

Trichoderma

El género Trichoderma presentó micelio septado, simple, delgado, hialino; conidióforo hialino; conidios hialinos amerosporas producidos apicalmente en masa de coloración verde sobre fiálides simples (Figura 3). En el Cuadro 4 se describen las especies encontradas de Trichoderma en El Arrayanal (TC-1, TC-2, TC-4, TC-6) y Tecoanapa (TG-1, TG-3, TG-4, TG-6).

En el Arrayanal se identificaron a nivel de género Cordyceps bassiana (identificado morfológicamente como Gliocladium) (GC), Paecilomyces (PC) y Clados-porium (CC); mientras que en Tecoanapa también se identificó a Paecilomyces (PG) y Cladosporium (CG).

Cordyceps bassiana (GC)

Es un microorganismo saprofito y común en los suelos. En PDA presentó micelio blanquecino algodonoso; conidióforos hialinos formando una brocha compacta; conidios hialinos o brillantemente coloreados en masa, unicelulares, producidos apicalmente (Figura 3).

Paecilomyces (PC y PG)

En PDA este hongo se caracteriza por presentar conidióforos con ramas divergentes; conidios (fialospo-ras) en cadena, unicelulares, de forma ovoide, hialinos (Barnett & Hunter, 1998) (Figura 3).

Cladosporium (CC y CG)

En PDA presentó conidios de color oscuro formados por una o dos células de tamaño variable, ovoides o cilíndricos y algunos de forma alimonada, arreglados en cadena simple o ramificadas (Barnett & Hunter, 1998) (Figura 3).

 

Caracterización molecular

Los productos de PCR con los primers ITS4 e ITS5 tuvieron un peso aproximado de 500 a 550 pb (pares de bases), lo que permitió la amplificación de las bandas que se observan en la Figura 4. Los resultados de la secuenciación de cada aislamiento fueron comparados con las secuencias reportadas en el banco de genes (NCBI). En las secuencias de este trabajo se consideró un alineamiento de 90 al 100 %. En el Cuadro 5 se reportan las especies que fueron registradas en el Banco de Genes obteniendo su número de acceso.

 

CONCLUSIONES

Todos los hongos aislados del suelo asociados con el arbolado de encino se reportan por vez primera en México. Se identificaron las especies de Trichoderma hipocrealixil, T. strigosum, T. spirale, T. longibrachiatum, T. citrinoviride, T. atroviride, Cordyceps bassiana y Cladosporium tenuissimun. Los aislamientos de Trichoderma, C. bassiana y Paecilomyces son los que ejercieron mejor biocontrol al reducir el desarrollo de P. cinnamomi en las pruebas in vitro mostrando mecanismos sobresalientes de competencia por espacio y micoparasitismo. Debido a ello, estos aislamientos nativos son buenos controladores biológicos.

 

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