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INTRODUCCIÓN
Múltiples factores pueden ser tomados en consideración para establecer programas de vitrificación exitosos y obtener altos ISEPVIG. En yeguas/burras una determinación exacta de la ovulación es crítica ya que esto permite la recuperación de embriones con el tamaño esperado. Si son pequeños, no requerirán la perforación de su cápsula embrionaria (Panzani et al., 2012a; Fanelli et al., 2020). Sin embargo, si son grandes requerirán preferentemente ser puncionados antes de su vitrificación (Hochi et al., 1995; Eldridge-Panuska et al., 2005; Scherzer et al., 2011; Wilsher et al., 2019; Fanelli et al., 2020; Wilsher et al., 2021). En general, el día PO seleccionado para intentar recuperar el embrión repercute en el porcentaje de embriones colectados. La recuperación exitosa de embriones equinos es influenciada por múltiples factores: edad, número de ciclos de la donadora (Dorado et al., 2020), si el semen usado es fresco, refrigerado, o congelado (Meadows et al., 2000), tiempo de inseminación relativo a la ovulación (Eldridge-Panuska et al., 2005), época del año; en yeguas, pero no en burras (Peréz-Marín et al., 2017; Dorado et al., 2020), numero de ovulaciones por ciclo; individual o múltiple (Squires et al., 1985), fertilidad del caballo o burro (Peréz-Marín et al., 2017; Dorado et al., 2020) y otros factores (Allen et al., 1985). En la mayoría de los casos el promedio de recuperación embrionaria es mayor de cincuenta por ciento; sin importar si su intento de colección se realiza ya sea el día sexto, séptimo, octavo, o noveno PO (Allen et al., 1985; Freeman et al., 1991; Hinrichs, 1990; Eldridge-Panuska et al., 2005).
Sin embargo, la visualización y manipulación del embrión equino son más fácil después del día séptimo PO; debido a su mayor tamaño cuando se compara con embriones colectados ya sea durante los días seis, o seis y medio PO. Un número pequeño de estudios comparan el porcentaje de preñez obtenidos con embriones cuando se usan distintos medios líquidos de colección (Oguri & Tsutsumi, 1974), lavado, mantenimiento (Oguri & Tsutsumi, 1974), y transferencia (Carnavale et al., 2000; Eldridge-Panuska et al., 2005). La información también es escasa cuando se compara las distintas soluciones vitrificantes y el porcentaje de preñez logrado cuando se emplean cada una de ellas. Hay muchas opciones que pueden ser seleccionadas como porta embriones entre ellas están el open pulled straw o OPS (Guignot et al., 2015); la micro-pipeta de diámetro fino (Choi et al., 2011); el cryolock (Díaz et al., 2016; Ferris et al., 2016; Wilsher et al., 2019); hemi straw (Sanchez et al., 2017), el Fibreplug-solid surface (Pérez-Marín et al., 2018) y el cryotop (Bottrel et al., 2019; Bottrel et al., 2020a; Bottrel et al., 2020b). Los embriones equinos pequeños no requieren contacto directo con el nitrógeno líquido para sobrevivir el proceso de criopreservación aun si se vitrifican en un volumen grande de solución p.ej. 30 micro litros (uL) (Eldridge-Panuska et al., 2005; Fanelli et al., 2020). Por otro lado, si los embriones equinos son grandes, aparte de la perforación de su capsula (Wilsher et al., 2021) y la extracción de su líquido blastocélico (Sanchez et al., 2017; Herrera, 2021) preferentemente requerirán contacto directo con el nitrógeno líquido (Díaz et al., 2016; Sanchez et al., 2017; Herrera, 2021). Al parecer cuando se trabaja con embriones equinos grandes (aparte de la perforación de su cápsula y la extracción de su líquido blastocélico), cuando se compara entre los sistemas abiertos y cerrados los cuales permiten el contacto directo e indirecto con el nitrógeno líquido durante la etapa de vitrificación; que los sistemas abiertos permiten un ITT mayor por lo que se aumenta el ISEPVIG (Sanchez et al., 2017). Además, el volumen de líquido usado para mantener embriones grandes durante la etapa de vitrificación debe preferentemente ser pequeño (usualmente < 1 uL) para incrementar el ITT (Díaz et al., 2016; Sanchez et al., 2017). Otro factor que debe influenciar la sobrevivencia embrionaria es el diámetro de la micro pipeta empleada para perforar su cápsula; sin embargo, existen datos limitados y no claros acerca de este tema (Choi et al., 2010; Díaz et al., 2016; Ferris et al., 2016; Sanchez et al., 2017; Wilsher et al., 2021). Finalmente, las soluciones líquidas seleccionadas para transferir el embrión al útero de la yegua o burra deben ser analizado de manera cuidadosa. Mas investigación es requerida en el área de reproducción y criobiología donde los embriones equinos son un modelo fácil para trabajar; ya que estos se pueden colectar de manera fácil, manipularse y transferirse de regreso al útero de yeguas, burras, mulas y/o burdéganas. El objetivo del presente estudio es proveer una guía fácil acerca de los factores relevantes asociados con la vitrificación embrionaria, ambos: en yeguas y burras, establecer áreas donde existe información limitada o es ausente, y promover ideas que ayuden a realizar investigaciones futuras en el área de criobiología y reproducción equina.
Porcentaje de embriones recuperados en yeguas y burras en relación al día de ovulación
Existe mucha variación en el porcentaje de embriones colectados en yeguas cuando se toma como consideración el día en el cual se intenta recuperarlos. Por ejemplo; en el sexto, séptimo, u octavo día PO el porcentaje de recuperación reportado varía de cero (Battut et al., 1997), sesenta y dos (Camillo et al., 2003), a cien por ciento (Hochi et al., 1995) respectivamente. Sin embargo, porcentajes de recuperación cercanos o mayores a cincuenta por ciento son indicados por la mayoría de los estudios (Allen et al., 1985; Iuliano et al., 1985; Squires et al., 1985; Hinrichs, 1990; Freeman et al., 1991; Hochi et al., 1995; Maclellan et al., 2002; Eldridge-Panuska et al., 2005; Moussa et al., 2005; Derbala & Abdou, 2017; Silva et al., 2018; Roser et al., 2020). Cuando la colección embrionaria se intenta temprano (día sexto PO), el porcentaje de recuperación varía de cero (Battut et al., 1997) a ochenta y dos por ciento (Hochi et al., 1995). La dramática diferencia previa entre reportes podría ser parcialmente atribuida a la experiencia del personal ya que la búsqueda y observación embrionaria son más difíciles durante la etapa de desarrollo temprano (día sexto PO) cuando el tamaño del embrión es usualmente ≤ 300 µmØ. Aunque no es posible hacer comparaciones directas en el porcentaje de recuperación promedio debido a la diferencia de metodología y número de animales usados en cada estudio, en general; se muestra que el porcentaje de colección exitoso tiende a ser menor cuando se intenta temprano (día sexto PO comparado con días posteriores). Interesantemente, ha sido posible incrementar el porcentaje de recuperación embrionaria mediante modificaciones en la técnica de colección; por ejemplo, permitiendo que la solución líquida de flushing o recuperación permanezca unos minutos más dentro del útero (Hinrichs, 1990; Alvarenga et al., 1993).
Aparte de mostrar un alto grado de variación, los datos relacionados con el porcentaje de recuperación embrionaria por día son muy limitados en burras (Allen et al., 1985; Vendramini et al., 1997; Camillo et al., 2010; Peña-Alfaro et al., 2014; Bottrel et al., 2017; Pérez- Marín et al., 2017; Ottmann et al., 2018; Dorado et al., 2020). Durante el día sexto PO, el porcentaje de recuperación embrionaria varía de cuarenta y tres (Vendramini et al., 1997) a setenta y cinco (Dorado et al., 2020). En el día siete PO, la recuperación reportada va del doce (Camillo et al., 2010) a ochenta por ciento (Dorado et al., 2020). Alternativamente, si se intenta recuperar el embrión ya sea el día ocho o el día nueve PO, el porcentaje de recuperación embrionaria es por lo general superior al cincuenta por ciento (Camillo et al., 2010; Peña-Alfaro et al., 2014; Dorado et al., 2020). Como se mencionó previamente, el porcentaje de recuperación embrionaria en équidos puede ser influenciado por muchos factores tales como el número de ciclos estrales de la donadora (Dorado et al., 2020), el tipo de semen utilizado para inseminar a la hembra (Meadows et al., 2000), la relación entre el tiempo de inseminación y el tiempo de ovulación (Eldridge-Panuska et al., 2005), la época del año en yeguas pero no en burras (Peréz-Marín et al., 2017; Dorado et al., 2020), el número de ovulaciones por ciclo estral (Squires et al., 1985), la fertilidad de los machos utilizados (Peréz Marín et al., 2017; Dorado et al., 2020) entre otros (Allen et al., 1985).
La relación entre el día de recuperación y el tamaño del embrión
En yeguas, el tamaño del embrión es influenciado de manera dramática por el día PO seleccionado para implementar su recuperación (Betteridge et al., 1982; Hochi et al., 1995; Eldridge-Panuska et al., 2005; Choi et al., 2010; McCue et al., 2010; Díaz et al., 2016; Guignot et al., 2016; Wilsher et al., 2019). Por lo general, si el embrión es colectado ya sea durante el día sexto o sexto y medio PO, este será ≤ 300 µmØ (Iuliano et al., 1985; Freeman et al., 1991; Eldridge-Panuska et al., 2005; Hudson et al., 2006; Choi et al., 2010; Guignot et al., 2015; Pérez- Marín et al., 2017; Pérez-Marín et al., 2018; Silva et al., 2018). Por el contrario, cuando la recuperación embrionaria se realiza durante el día siete, siete y medio; ocho, ocho y medio; o nueve, estos por lo general serán >300 µmØ (Hochi et al., 1995; McCue et al., 2010; Díaz et al., 2016; Pérez- Marín et al., 2017; Wilsher et al., 2019).
Estudios en burras que describan la relación entre el tamaño del embrión y el día durante el cual fueron colectados son escasos. Sin embargo, parece que contrario a lo reportado en yeguas un alto porcentaje de los embriones colectados durante el día séptimo, o séptimo y medio PO son todavía < 300 µmØ (Vendramini et al., 1997; Panzani et al., 2012b; Bottrel et al., 2017; Pérez- Marín et al., 2017; Pérez-Marín et al., 2018; Bottrel et al., 2019; Bottrel et al., 2020b; Dorado et al., 2020; Fanelli et al., 2020). Cuando la colección del embrión burro es intentada ya sea el día ocho PO o posteriormente, su diámetro es usualmente cercano a o mayor a 500 µmØ (Panzani et al., 2012a; Pérez- Marín et al., 2017; Bottrel et al., 2019; Dorado et al., 2020).
Protocolos que incluyen o excluyen la punción de la cápsula embrionaria (CE) antes de la vitrificación
La cápsula no requiere ser puncionada antes del proceso de vitrificación si el tamaño del embrión caballo es ≤300 µmØ, y el ISEPVIG obtenido con estos embriones es usualmente superior al treinta por ciento (Eldridge-Panuska et al., 2005; Hudson et al., 2006; Choi et al., 2011; Analizado previamente por Urías-Castro & Boeta, 2020). La mayoría de los reportes acerca de la vitrificación de embriones equinos indican que cuando el embrión caballo es ˃300 µmØ este deberá ser puncionado para perforar su CE y además su liquido blastocélico extraído para optimizar el ISEPVIG (Choi et al., 2011; Guignot et al., 2015; Díaz et al., 2016; Ferris et al., 2016; Sánchez et al., 2017; Wilsher et al., 2019; Analizado previamente por Urías-Castro & Boeta, 2020). Sin embargo, cuando se toman en consideración más categorías en términos de tamaño embrionario; se observa que la vitrificación de embriones equinos de entre 300 y 550 µmØ de tamaño (≤ 550 µmØ); la perforación de la CE sin aspiración de su líquido blastocélico resulta en porcentajes de gestación superiores al 75% (Wilsher et al., 2021).
Estudios que reporten el ISEPVIG cuando se usan embriones burro son escasos. El trabajo disponible muestra que la vitrificación de embriones burro ≤300 µmØ resulta en porcentajes de gestación que varían de treinta y seis por ciento al día catorce de gestación (D14), a veintisiete por ciento al día veinticinco de gestación (D25); lo que sugiere que si el embrión burro es ≤300 µmØ, la punción de la CE y la extracción del líquido blastocélico no son esenciales (Panzani et al., 2012b). Proyectos de investigación que describan la punción de la CE de embriones burro y la extracción de su líquido blastocélico son limitados (Ottmann et al., 2018). La pregunta de si los embriones burro ˃300 µmØ requieren la punción de la CE y extracción del líquido blastocélico para incrementar el ISEPVIG ha sido contestada de manera indirecta solamente, ya que la punción de la CE y la extracción del líquido blastocélico resultaron en un porcentaje alto de sobrevivencia embrionaria en vitro (Ottmann et al., 2018; previamente analizado por Urías-Castro & Boeta, 2020).
Infusión intrauterina de soluciones líquidas para colectar embriones equinos
Algunos de los primeros estudios en describir la colección de embriones equinos reportaban el uso de solución salina fisiológica, esta última contenía dos por ciento de polvo de gelatina (Oguri & Tsutsumi, 1974). Hoy en día, el uso de lactato de Ringer (Alvarenga et al., 1993; Barfield et al., 2008; Sánchez et al., 2017; Wilsher et al., 2019); cuya composición es cercana a la solución Hartmann también ha sido descrita (Guignot et al., 2015). Otra solución líquida empleada para recuperar embriones equinos es la solución salina buferada con fosfato Dulbeccos o DPBS/PBS (Alvarenga et al., 1993; Landim E Alvarenga et al., 1993). Una solución salina buferada con fosfato Dulbeccos modificada (DMPBS) combinada con suero fetal de Becerra (FCS) ha sido reportada por Hinrichs (1990). La DMPBS puede ser suplementada con suero inactivado por calor de torete castrado (McKinnon & Squires, 1988); o albumina de suero bovino (BSA) más antibióticos (Battut et al., 1997). La DMPBS mezclada ya sea con uno por ciento de FCS o suero de becerra más glucosa y piruvato, ha sido descrita también como una solución líquida para recuperar embriones equinos (Carnavale et al., 2000). La solución flushing de tipo comercial Emcare® (Eldridge-Panuska et al., 2005) y la solución flushing Vigro® (Hudson et al., 2006) son otras alternativas reportadas como soluciones líquidas para recuperar embriones.
En burras, la solución de lactato de Ringer es la reportada más frecuentemente como solución de recuperación embrionaria (Panzani et al., 2012a; Peña-Alfaro et al., 2014; Panzani et al., 2016; Pérez-Marín et al., 2018; Bottrel et al., 2019; Bottrel et al., 2020a; Bottrel et al., 2020b). Otra alternativa reportada es la DPBS (Camillo et al., 2010).
Soluciones líquidas usadas para mantener los embriones equinos recuperados
Los soluciones de mantenimiento más simples en términos de composición son ya sea la solución salina con dos por ciento de polvo de gelatina, o la solución de lactato de Ringer con suero de yegua (1:1, v/v) y con mil unidades internacionales de penicilina por mililitro (Oguri & Tsutsumi, 1974). Una alternativa más completa en términos de composición es el medio de Ham F10, este último es complementado con diez por ciento de FCS mas uno porciento de penicilina/estreptomicina; este medio es gasificado con cinco por ciento de dióxido de carbono, oxigeno, y noventa por ciento de nitrógeno (Carnavale et al., 2000). Los medios de mantenimiento comercial Vigro® (Hudson et al., 2006) y Syngro® (Barfield et al., 2009) también han sido descritos. Investigadores franceses han trabajado con el medio EHM, el cual es una solución liquida a base de PBS que contiene cuatro gramos de BSA por litro (Guignot et al., 2015). Investigadores de la Universidad del estado de Colorado han reportado la utilización del medio DMEM/F12 (sales inorgánicas, aminoácidos, vitaminas, antibióticos y otros) suplementado con veinte por ciento de suero fetal bovino - DMEM/F12/FBS (Ferris et al., 2016). El DMPBS sin calcio y magnesio, complementado con diez por ciento de FBS y cincuenta microgramos de gentamicina por mililitro ha sido empleado por Sánchez et al. (2017). Alternativamente, el medio M-199 Hepes suplementado con diez por ciento de FBS mas uno por ciento de antibióticos (100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina) ha sido descrito como una solución líquida para mantener embriones (Wilsher et al., 2019).
El PBS y el lactado de Ringer han sido reportados como medios de mantenimiento para embriones burro (Camillo et al., 2010). El uso de la solución comercial Emcare Holding Solution® está documentada también por varios investigadores como solución de mantenimiento para embriones burro (Camillo et al., 2010; Panzani et al., 2012a). Otra alternativa usada como solución de mantenimiento con embriones burro es la Vitrocell®, la cual contiene cero punto cuatro por ciento de BSA (Peña-Alfaro et al., 2014). El medio de mantenimiento Syngro® ha sido empleado con embriones burro antes de transferirlos al útero de mulas (Bottrel et al., 2017). El uso de un medio de mantenimiento isotónico (IVM-Technologies) ha sido reportado por Pérez-Marín et al. (2018). Recientemente, Bottrell y su equipo ha reportado el uso de TCM-199 HEPES complementado con veinte por ciento de FCS como un medio de mantenimiento para embriones burro (Bottrel et al., 2019).
Medio para el lavado y manipulación embrionaria
Una solución líquida que ha sido empleada en yeguas para lavar y manipular los embriones colectados es la PBS; esta es usualmente suplementada con suero de origen animal como el suero fetal de becerra FCS (Alvarenga et al., 1993). El uso de PBS sin calcio y magnesio, suplementada con piruvato de sodio, glucosa, y FCS ha sido documentada por Eldridge-Panuska et al. (2005). Una solución de PBS que contiene albumina de suero bovino (BSA) también es reportada como un medio para lavar/manipular embriones (Guignot et al., 2015). Otras opciones para el lavado de embriones son la solución Vigro® (Hudson et al., 2006; Barfield et al., 2008) y el medio Syngro® (Barfield et al., 2009). El uso de DMEM/F12 suplementado con veinte por ciento de suero fetal bovino (FBS) ha sido reportado por Ferris et al. (2016). Una solución denominada Dulbecco’s PBS (DPBS) con diez por ciento de FCS ha sido empleada para lavar embriones equinos por los investigadores de la universidad del estado de Colorado (Carnavale et al., 2000). Otro medio para lavar embriones que ha sido documentado es el M-199 HEPES, este último conteniendo diez por ciento de FBS, penicilina y estreptomicina (Wilsher et al., 2019).
Para embriones de asnos, la Emcare Holding Solution® ha sido descrita de manera frecuente para lavar/manipular embriones (Camillo et al., 2010; Panzani et al., 2012a; Panzani et al., 2012b; Panzani et al., 2016). El medio de mantenimiento Syngro® es empleado como solución de lavado embrionario por varios investigadores (Bottrel et al., 2017; Pérez- Marín et al., 2017; Bottrel et al., 2019; Bottrel et al., 2020a; Bottrel et al., 2020b). Alternativamente, el PBS (Camillo et al., 2010), el lactato de Ringer (Camillo et al., 2010), y el medio de mantenimiento isotónico han sido descritos también como soluciones para el lavado embrionario en asnos (Pérez-Marín et al., 2018).
Tamaño de la micro-pipeta y punción de la cápsula embrionaria (CE)
No hay estudios que de manera formal correlacionen en tamaño de la punta de la micro-pipeta usada para perforar la CE y su asociación con el ISEPVIG. La mayoría de los experimentos donde se punciona la CE son diseñados con puntas de micropipeta iguales o menores a los dieciséis micrómetros de diámetro (umØ); tal como ha sido descrito en distintos estudios (Choi et al., 2010; Choi et al., 2011; Hinrichs & Choi, 2012; Guignot et al., 2015; Díaz et al., 2016; Sánchez et al., 2017). Solo un par de investigadores han demostrado la sobrevivencia embrionaria como reflejo de los porcentajes de gestación, después de puncionar la CE con puntas de micro-pipetas mayores a los dieciséis umØ (Wilsher et al., 2019). Se han reportado gestaciones aún después de puncionar le CE con agujas calibre veinticinco (Ferris et al., 2016). Por otro lado; cuando se trabaja con embriones de burra, estos generalmente son vitrificados en una etapa de desarrollo en la cual son ≤ 300 umØ, y por ende no se requiere ni la punción ni la reducción de tamaño (Panzani et al., 2012b; Pérez-Marín et al., 2018; Bottrel et al., 2019). El sistema de micro manipulación Piezo drill ha sido descrito en un estudio donde se emplearon embriones fenotipo burro grandes >300 µmØ (Ottmann et al., 2018), y este sistema por lo general emplea micro-pipetas con una punta de entre 7-15 umØ (Choi et al., 2011; Hinrichs & Choi, 2012; Hiraoka & Kitamura, 2015). Sin embargo, en el estudio hecho por Ottman y sus colaboradores, los embriones no fueron transferidos al útero de hembras después de ser calentados y solo la sobrevivencia in vitro fue reportada (Ottmann et al., 2018). Un estudio reciente ha reporto la punción de blastocitos equinos con aguja (punta < 1µm) ultra fina (Wilsher et al., 2021).
Soluciones criopreservadoras empleadas para vitrificar embriones equinos
La mayoría de los protocolos empleados para vitrificar embriones caballo utilizan una mezcla de criopreservadores penetrantes tales como el dimetil sulfoxido (DMSO), etilen glicol y glicerol. Otros protocolos incluyen la colocación del embrión en una mezcla de criopreservadores penetrantes tales como el etilen glicol, o etilen glicol y DMSO; los cuales son mezclados con criopreservadores no penetrantes tales como la galactosa o la sucrosa. Por ejemplo, el embrión es puesto en una primera solución que contiene una baja concentración de glicerol, y después es removido de esta última solución y puesto de manera sucesiva en soluciones que contienen concentraciones mayores de glicerol y etilen glicol (Eldridge-Panuska et al., 2005; Díaz et al., 2016; Sánchez et al., 2017; Pérez-Marín et al., 2018). Por otra parte, la vitrificación de embriones caballo con una solución que contiene etilen glicol y DMSO también ha sido descrita (Choi et al., 2011; Sánchez et al., 2017; Wilsher et al., 2019). En estos últimos protocolos se empieza poniendo el embrión en una solución con una concentración baja de etilen glicol y DMSO. Posterior al paso inicial, el embrión es colocado de manera secuencial en soluciones con una concentración mayor de los criopreservadores. Otras soluciones criopreservadoras utilizadas para vitrificar embriones caballo contienen una baja concentración de etilen glicol (solución inicial), y posterior a esto usan otra solución final denominada solución vitrificante. La solución final es compuesta de galactosa y es adicionada con altas concentraciones de etilen glicol (Choi et al., 2011; Guignot et al., 2015; Ferris et al., 2016; Guignot et al., 2016). Para la vitrificación de embriones fenotipo burro, un protocolo ha sido adaptado a partir de los estudios iniciales hechos para vitrificar embriones fenotipo caballo por parte de Eldridge-Panuska et al. (2005); este protocolo consiste típicamente de tres etapas o pasos, con una solución específica para cada paso. Por ejemplo, la solución uno contiene solamente glicerol; la solución dos tiene una mezcla de glicerol y etilen glicol; y la solución tres contiene concentraciones mayores tanto de glicerol como de etilen glicol (Panzani et al., 2012b; Panzani et al., 2016; Pérez-Marín et al., 2018). Otros estudios donde se vitrificaron embriones fenotipo burro fueron diseñados al tomar en cuenta la investigación hecha por Campos-Chillon et al. (2009). Estos utilizaron soluciones que contenían etilen glicol, y etilen glicol complementado con galactosa (Ottmann et al., 2018; Pérez-Marín et al., 2018). Otros han usado una solución inicial que contiene una mezcla de etilen glicol y DMSO; después de usar esta última, una segunda solución que contiene etilen glicol, DMSO, y sucrosa es empleada (Bottrel et al., 2019; Bottrel et al., 2020a; Bottrel et al., 2020b).
Porta embriones y volúmenes de carga empleados durante el proceso de vitrificación
Popotes no irradiados de cloruro de polivinilo con capacidad de cero punto veinticinco mililitros (mL) fueron uno de los primeros porta embriones descritos en especies equinas y han sido usados de manera frecuente a partir de entonces (Oberstein et al., 2001; Eldridge-Panuska et al., 2005; Hudson et al., 2006; Hendriks & Stout, 2010; Choi et al., 2011; Hendriks et al., 2015; Sánchez et al., 2017). Opuesto a los popotes de polivinilo los cuales emplean un volumen grande de solución durante el paso final de vitrificación; el sistema cryolock permitió a los investigadores vitrificar embriones fenotipo caballo en un volumen líquido pequeño (Díaz et al., 2016; Ferris et al., 2016; Wilsher et al., 2019). La vitrificación de embriones equinos usando volúmenes líquidos pequeños es conseguida con porta embriones tales como el open pulled straw (Oberstein et al., 2001; Moussa et al., 2005; Guignot et al., 2015; Guignot et al., 2016), el fibreplug (Pérez-Marín et al., 2018), el cryoloop (Oberstein et al., 2001), la punta de micro-pipeta de micro carga de diámetro fino o fine diameter microloader pipette tip (Choi et al., 2011), el cryoleaf (Scherzer et al., 2011), el hemi straw (Sánchez et al., 2017) y el stripper tip (Sánchez et al., 2017).
Los embriones fenotipo caballo pueden ser vitrificados utilizando diferentes volúmenes de soluciones líquidas. Los volúmenes usados para cargar el embrión en el porta embriones varían desde cincuenta (Oberstein et al., 2001) a treinta uL (Eldridge Panuska et al., 2005; Hudson et al., 2006; Hendriks & Stout, 2010; Choi et al., 2011; Hendriks et al., 2015). Volúmenes de carga cercanos a los tres o dos uL han sido reportados (Moussa et al., 2005; Guignot et al., 2015; Sánchez et al., 2017; Pérez Marín et al., 2018; Wilsher et al., 2019). Volúmenes para cargar embriones cercanos o menores a un uL son descritos también (Oberstein et al., 2001; Díaz et al., 2016; Sánchez et al., 2017).
Cuando se trabaja con embriones fenotipo burro, el popote de cloruro de polivinilo no irradiado con capacidad de cero punto veinticinco mL ha sido reportado como porta embrión (Panzani et al., 2012b; Fanelli et al., 2020). Distintos porta embriones con capacidad de volumen pequeño han sido descritos de manera reciente para la vitrificación de embriones fenotipo burro; estos incluyen el cryotop (Bottrel et al., 2019; Bottrel et al., 2020a; Bottrel et al., 2020b), el open pulled straw (Ottmann et al., 2018) y el fibreplug (Pérez-Marín et al., 2018). Un volumen de solución líquida de treinta uL ha sido usado para vitrificar embriones fenotipo burro (Panzani et al., 2012b); pero porta embriones de bajo volumen de carga, empleando volúmenes que van de tres a menos de un uL han sido utilizados también (Pérez-Marín et al., 2018; Bottrel et al., 2019; Bottrel et al., 2020a; Bottrel et al., 2020b).
Soluciones líquidas usadas para calendar embriones
Con poca variación entre protocolos, el medio líquido usado para calendar embriones caballo usualmente contiene una concentración igual o menor a cero punto tres molar de sucrosa. Los embriones caballo son calentados y mantenidos por alrededor de un minuto en el medio líquido anteriormente mencionado. Después de lo anterior, los embriones son puestos en un segundo medio; este último tiene una concentración cercana o menor a cero punto quince molar de sucrosa; finalmente, el embrión es puesto en un medio líquido el cual no contiene sucrosa durante el paso final del proceso de calentamiento (Choi et al., 2011; Guignot et al., 2015; Ferris et al., 2016; Guignot et al., 2016; Wilsher et al., 2019). Un protocolo de calentamiento de un solo paso fue reportado por Eldridge-Panuska et al. (2005) en este se utilizaba una solución de galactosa de cero punto cinco molar. El protocolo de calentamiento de un solo paso ha sido implementado también en otros estudios (Choi et al., 2011; Díaz et al., 2016; Sánchez et al., 2017). Algunos investigadores calientan el embrión equino usando un protocolo de tres pasos; en el primer paso, el embrión es colocado en una solución uno molar de galactosa; en el segundo paso, el embrión permanece en una solución cero punto cinco molar de galactosa; y durante el tercer paso, el embrión es colocado en una solución líquida de cero punto veinticinco molar de galactosa (Campos-Chillon et al., 2009; Choi et al., 2011).
Así como se ha descrito para embriones fenotipo caballo (Eldridge-Panuska et al., 2005), el calentamiento de embriones fenotipo burro se lleva a cabo con un medio o solución de cero punto cinco molar de galactosa en lo que se denomina protocolo de calentamiento directo de un solo paso (Panzani et al., 2012b; Panzani et al., 2016). Otros protocolos emplean una solución de calentamiento de cero punto veinticinco molar de galactosa (Pérez-Marín et al., 2018). En algunos protocolos de calentamiento, el embrión fenotipo burro es colocado de manera secuencial en soluciones líquidas las cuales tienen concentraciones decrecientes de sucrosa (Ottmann et al., 2018; Pérez-Marín et al., 2018; Bottrel et al., 2019; Bottrel et al., 2020a). Un estudio reciente ha comparado la calidad post vitrificación (calentados) de los embriones fenotipo burro cuando se emplea ya sea el protocolo de tres pasos con diluciones de sucrosa o cuando se usa el protocolo de un solo paso con solución de sucrosa (Bottrel et al., 2020b).
Medios líquidos utilizados para la transferencia intrauterina de embriones equinos
Algunos componentes de las soluciones líquidas usadas para transferir embriones equinos fueron descritos por primera vez durante la década de los setenta por Oguri & Tsutsumi (1974). En este estudio, se reportaron dos soluciones de transferencia diferentes: una solución salina que contenía dos por ciento de polvo de gelatina y una solución de lactato de Ringer suplementada con suero de yegua y antibióticos. Hay dos técnicas de transferencia embrionaria post calentamiento reportadas por Eldridge-Panuska et al. (2005). La primera emplea PBS mas diez por ciento de FCS como un medio de transferencia, una vez que se remueve el embrión de la solución con galactosa que se empleó durante el calentamiento. La segunda es una técnica de transferencia directa post calentamiento. Esta última técnica consiste en mezclar la solución vitrificante que contiene el embrión (treinta micro litros de tres punto cuatro molar de glicerol y cuatro punto seis molar de etilen glicol) con dos columnas de líquido (de cero punto cinco molar de galactosa en PBS) de noventa micro litros cada una (Eldridge-Panuska et al., 2005). En la técnica anterior, tanto la solución vitrificante como la de calentamiento son mezcladas en la pajilla o popote durante el proceso de calentamiento, formando una solución diluida que contiene el embrión el cual es posteriormente transferida al útero de la yegua (Hudson et al., 2006). El medio de mantenimiento Syngro® ha sido reportado como una solución de transferencia para embriones también (Barfield et al., 2008; Sánchez et al., 2017). Investigadores franceses experimentaron con un medio de cultivo sintético modificado de fluido de oviducto y lo usaron como un medio de transferencia para embriones (Guignot et al., 2015).
La solución de mantenimiento EmCare® ha sido empleada para transferir embriones fenotipo burro por investigadores italianos y españoles (Panzani et al., 2006; Panzani et al., 2012a; Camillo et al., 2010). Otros reportan como medios de transferencia ya sea el PBS o el lactato de Ringer (Camillo et al., 2003; Camillo et al., 2010). El medio de mantenimiento Vitrocell® con cero punto cuatro por ciento de BSA ha sido usado como medio de transferencia con embriones fenotipo burro por Peña-Alfaro et al. (2014). Un medio de mantenimiento isotónico (IMV technologies, L’Aigle, France) ha sido reportado como solución de transferencia para embriones burro también (Pérez Marín et al., 2018).
DISCUSIÓN
En años recientes, la vitrificación embrionaria en especies equinas no convencionales se ha vuelto frecuente (Bottrel et al., 2019; Bottrel et al., 2020a; Bottrel et al., 2020b; Fanelli et al., 2020). Aun, la vitrificación, la transferencia embrionaria post vitrificación, y los índices de gestación son áreas que permanecen escasamente exploradas en embriones obtenidos a partir de burras (Ottmann et al., 2018; Pérez-Marín et al., 2018; Bottrel et al., 2019) y no se ha hecho investigación con embriones de fenotipo mula, burdégano u otros híbridos equinos. Estudios iniciales en yeguas permitieron obtener conocimiento acerca del tiempo al cual el embrión descendía al útero, fue entonces descrito que el embrión entraba al útero tan temprano como a las 120 horas (cinco días) PO (Freeman et al., 1991). La limitada disposición de burras y el número elevado que se ocupa para hacer investigación ha hecho difícil establecer de manera adecuada el tiempo de entrada por parte del embrión con fenotipo burro al útero de la burra. Es lógico pensar que el embrión con fenotipo burro desciende al útero de la burra alrededor o pronto después del día sexto PO (Allen et al., 1985; Vendramini et al., 1997; Pérez-Marín et al., 2017). Sin embargo, parece que en burras como ocurre en yeguas, la colección embrionaria es más exitosa si se practica más tarde en vez de más temprano en relación al día de ovulación. Además, el desarrollo temprano del embrión con fenotipo caballo parece ser más rápido cuando se compara con el embrión con fenotipo burro. Por ejemplo, cuando se colectan embriones al día séptimo o séptimo y medio PO, la mayoría de los embriones con fenotipo caballo son ≥ 300 µmØ (Hochi et al., 1995; McCue et al., 2010; Guignot et al., 2015; Wilsher et al., 2019), mientras que la mayoría de los embriones con fenotipo burro son ≤ 300 µmØ cuando se colectan durante los mismos días (Vendramini et al., 1997; Panzani et al., 2012b; Bottrel et al., 2017; Pérez- Marín et al., 2017; Pérez-Marín et al., 2018; Dorado et al., 2020).
Los embriones de las especies equinas desarrollan una cápsula glico-proteica (Stout et al., 2005) que cuando está más formada tiene una baja permeabilidad a los criopreservadores (Kingma et al., 2011; Scott et al., 2012). Estos cambios en la permeabilidad de la CE pueden ser asumidos también de manera indirecta al analizar los estudios de vitrificación de embriones equinos ≤ 300 µmØ donde se reportan los ISEPVIG (Eldridge-Panuska et al., 2005; Hudson et al., 2006; Choi et al., 2011). Es probable que el alto ISEPVIG obtenido cuando se vitrifican embriones pequeños sea consecuencia de la naturaleza de estos embriones; los cuales tienen una cápsula menos desarrollada y son más permeables a los criopreservadores, por lo tanto, estos últimos pueden vitrificarse de manera fácil y obtener con ellos unos ISEPVIGs normales o altos. Por otro lado, los embriones con fenotipo caballo grandes >300 µmØ tienen una cápsula con una permeabilidad menor a los criopreservadores. Estos cambios en la permeabilidad de la CE puede ser corroborada cuando se analizan los datos obtenidos por Legrand et al. (2001). En el estudio previo se observó que los embriones equinos que contaban con una cápsula más gruesa o desarrollada, la entrada al embrión por parte de los criopreservadores tales como el glicerol era limitada (Legrand et al., 2001). Entonces, dependiendo de las subcategorías con respecto al tamaño de embrión solo la punción (Wilsher et al., 2021) o la punción y la aspiración del líquido blastocélico serán necesarias para obtener un alto ISEPVIG (Díaz et al., 2016; Sánchez et al., 2017). La pregunta acerca de cuáles subcategorías de embriones con fenotipo burro (en términos de tamaño: ≤ 300 µmØ, > 300 ≤ 500 µmØ, > 500 ≤ 1200 µmØ) requieren su cápsula puncionada y su líquido blastocélico aspirado antes de la etapa de vitrificación no ha sido investigada de manera completa todavía. Basado en estudios en caballos, y en limitados estudios en asnos (mirar sección previa de esta revisión); se puede inferir que los embriones de fenotipo burro requieren no solo de ser puncionados y su líquido blastocélico aspirado, pero también vitrificados, posteriormente calentados, y transferidos al útero de burras para calcular su ISEPVIG (Análisis de revisión hecho por Urías-Castro & Boeta, 2020).
En las especies equinas, los constituyentes de las soluciones líquidas para colectar embriones (SLPCE) fueron descritas por los estudios iniciales de Oguri (Oguri & Tsutsumi, 1974). Estos eran medios isotónicos conteniendo suero de origen animal, y en algunos casos eran suplementados con glucosa, piruvato, y antibióticos. Algunas SLPCE contienen carbohidratos y antibióticos; la decisión acerca de agregar estos últimos será tomada basado en distintos factores tales como la cantidad de tiempo que se empleara manipulando o manteniendo el embrión y si las instalaciones y el equipo usado son limpios o estériles. Al analizar los estudios que reportan el uso de distintos SLPCEs, es aparente que en yeguas (Guignot et al., 2015; Sánchez et al., 2017; Wilsher et al., 2019) y burras (Pérez-Marín et al., 2018; Bottrel et al., 2019) soluciones líquidas simples como el lactado de Ringer o la solución de Harman podrían ser buenas alternativas (lo cual tiene relevancia económica y práctica; ya que tanto el lactato de Ringer como la solución de Harman son por lo general más baratas y fáciles de obtener).
Existen muchas soluciones líquidas que pueden utilizarse para mantener embriones equinos. Algunos investigadores han empleado solución salina o lactato de Ringer. Existen soluciones más complejas tales como la Vigro® y la Syngro®, mientras que las más completas en términos de los requerimientos de nutrición embrionaria parecen ser la Ham’s F10 y la TCM-199. Sin embargo, pocos estudios han comparado los diferentes tipos de soluciones de mantenimiento y los efectos de emplear cada una de ellas sobre la sobrevivencia embrionaria, desarrollo, y/o porcentajes de gestación (Oguri & Tsutsumi, 1974; Alvarenga et al., 1993). El tipo de solución seleccionada dependerá de las circunstancias que prevalezcan durante los procesos de colección y mantenimiento, y de si el embrión será refrigerado, almacenado por horas, o procesado (transferido al útero) inmediatamente después de ser manipulado. Las soluciones líquidas utilizadas para lavar el embrión equino guardan una estrecha relación con las soluciones utilizadas como soluciones de mantenimiento. Sin embargo, cuando los medios de mantenimiento son usados como soluciones para lavar embriones a estas últimas soluciones usualmente se les agregan antibióticos.
La relación entre el diámetro de la punta de la micro-pipeta empleada para puncionar la CE y el efecto de esta sobre el ISEPVIG es un área que no ha sido investigada de manera completa en especies equinas, especialmente usando embriones con fenotipo burro o con fenotipo mula. Existe una variación dramática en el diámetro de la punta de la micro-pipeta usada para puncionar embriones grandes de equinos (> 300 µmØ) (Choi et al., 2011; Guignot et al., 2015; Díaz et al., 2016; Ferris et al., 2016; Sánchez et al., 2017; Wilsher et al., 2019; Wilsher et al., 2021).
Existen múltiples protocolos para vitrificar embriones equinos; sin embargo, los datos son limitados cuando se compara el ISEPVIG obtenido cuando se emplean cada uno de ellos (Choi et al., 2010; Pérez-Marín et al., 2018). Será interesante investigar más a fondo diferentes categorías en términos de tamaño embrionario (≤ 300 µmØ, > 300 ≤ 500 µmØ, > 500 ≤ 1200 µmØ) y la susceptibilidad de cada grupo a un protocolo de vitrificación especifico. La vulnerabilidad del embrión a un solo criopreservador como el glicerol (Scott et al., 2012), o a diferentes combinaciones: etilen glicol y glicerol (Kingma et al., 2011); etilen glicol y DMSO - etilen glicol y galactosa (Campos-Chillon et al., 2009), es un área en la que se espera una investigación más a fondo usando asnos, mulas, burdéganos y otros embriones híbridos. La permeabilidad embrionaria y la sobrevivencia embrionaria post vitrificación es un tema que ha sido parcialmente descrito antes, tanto para embriones producidos en vivo (Kingma et al., 2011; Scott et al., 2012) como para embriones fenotipo caballo producidos en vitro (Campos-Chillon et al., 2009).
En términos generales, cuando el embrión es reducido de tamaño (ya sea porque es pequeño al momento de ser colectado; o porque es reducido de tamaño mediante la punción de la CE y aspiración del líquido blastocélico) y cuando se utiliza un volumen pequeño de solución líquida con el (menos de un micro litro) durante la etapa de vitrificación la probabilidad de la formación de hielo es disminuida ya que un alto TTI es inducido al sumergir el embrión de manera directa con el nitrógeno líquido (Analizado previamente por Urías-Castro & Boeta, 2020). Interesantemente, en los reportes iniciales que describen la vitrificación exitosa de embriones equinos pequeños los cuales resultaron en índices normales o altos de gestación, se utilizaron porta embriones con volúmenes grandes de carga, en estos casos los embriones eran criopreservados usando un volumen de treinta micro litros de solución vitrificante (Eldridge-Panuska et al., 2005). Entre más pequeño es el embrión menor es el volumen de carga que el investigador puede usar durante el proceso de vitrificación. Sin embargo, la problemática está presente cuando el embrión es >300 µmØ. Lo anterior es debido a que entre más grande es el embrión mayor es el volumen necesario para cargar el embrión en el porta embrión durante el proceso de vitrificación. La problemática mencionada previamente hace más difícil el alcanzar un alto ITT, lo que a su vez evita poder reducir la formación de hielo y puede también dar como resultado una disminución en el porcentaje de sobrevivencia embrionaria durante las etapas de vitrificación y calentamiento. La dificultad de lograr un alto ISEPVIG en embriones >300 µmØ esta aun presente después de practicarles la punción de la CE y la aspiración del líquido blastocélico, especialmente con embriones >800 µmØ los cuales son difíciles de cargar en el porta embriones usando un volumen pequeño de solución líquida para vitrificarlos (experiencia personal).
El proceso de calentamiento o desvitrificación embrionaria usualmente se inicia con soluciones líquidas de galactosa o sucrosa las cuales varían en su molaridad de cero punto dos a cero punto tres, cero punto cinco, o incluso concentraciones uno molar. Una vez calentado, el embrión es puesto de manera secuencial en soluciones con una molaridad cada vez menor de galactosa/sucrosa. En las etapas finales del proceso de calentamiento, el embrión es puesto en soluciones que no contienen galactosa/sucrosa. Otros protocolos emplean una técnica denominada transferencia directa post calentamiento, la cual consiste en colocar el embrión en una solución cero punto cinco molar de sucrosa (el uso de este último protocolo tiene implicaciones prácticas ya que permite la transferencia directa del embrión una vez que este fue calentado). En este último protocolo el embrión es calentado en la solución final y es transferido directamente al útero de la yegua. Pocos estudios han investigado la relación entre el tamaño del embrión (≤ 300 µmØ or >300 µmØ) y la susceptibilidad de cada uno de ellos a soluciones con molaridades específicas de sucrosa/ galactosa (Choi et al., 2011; Bottrel et al., 2019; Bottrel et al., 2020a; Bottrel et al., 2020b). Por ejemplo, embriones grandes (>300 µmØ) podrían requerir más tiempo para alcanzar un equilibrio osmótico durante el proceso de calentamiento; debido lo anterior a la presencia de una capsula embrionaria más desarrollada la cual probablemente tenga menor permeabilidad. Es necesario investigar más a fondo las diferentes molaridades de las soluciones de calentamiento empleadas con embriones grandes de equinos. Ajustar las molaridades por subcategorías de tamaño embrionario (>600 ≤ 900 µmØ; >900 ≤ 1200; >1200 ≤ 1500 µmØ) podría mejorar los protocolos de calentamiento y el ISEPVIG. Un alto rango de variabilidad en la susceptibilidad embrionaria puede esperarse en base a las molaridades de las soluciones de calentamiento (basado en el grado de desarrollo y permeabilidad de la CE). No se ha establecido de manera clara si los embriones con fenotipo burro/caballo tienen diferentes susceptibilidades a los procesos de vitrificación y/o calentamiento (Bottrel et al., 2020a; Bottrel et al., 2020b). Por ejemplo, los embriones fenotipo burro parecen ser menos proclives al daño ocasionado por la vitrificación (Pérez-Marín et al., 2018; Bottrel et al., 2020a; Bottrel et al., 2020b). La diferencia previa en términos de susceptibilidad entre embriones fenotipo caballo o fenotipo burro podría explicarse de manera parcial por diferencias en términos de permeabilidad hacia las sustancias criopreservadoras. Si la menor susceptibilidad que parecen presentar los embriones fenotipo burro a la vitrificación también se refleja en una menor susceptibilidad al calentamiento, es un tema que requiere más investigación.
Existen muchas alternativas de soluciones líquidas que pueden ser usadas para depositar intrauterinamente los embriones de équidos. La solución y el volumen para cargar y transferir el embrión dependerán del tamaño de este último. En general, una pipeta de inseminación puede ser usada si el embrión es grande (>300 µmØ). Una pajilla o popote de cero punto cinco o cero punto veinticinco mL pueden emplearse si el embrión es pequeño (≤ 300 µmØ). Soluciones líquidas simples como la salina fisiológica y/o lactato de Ringer (las cuales son baratas y fáciles de obtener) suplementadas con polvo de gelatina son alternativas que pueden usarse para transferir embriones de fenotipo caballo, burro, mula o burdégano. La PBS y los medios comerciales como el Syngro son otras opciones que pueden ser usadas como soluciones de transferencia embrionaria (sin embargo, son más difíciles de obtener y usualmente más caras). Otras alternativas pudieran proveer condiciones más estables para la nutrición y el desarrollo de los embriones equinos. Estas últimas pueden incluir los medios de cultivo suplementado con fluido sintético de oviducto o la PBS modificada de Dulbeccos. En asnos, las soluciones para transferencia embrionaria reportados de manera frecuente son el Emcare, la PBS, y la solución de mantenimiento Vitrocell®. No hay estudios que de manera metódica investiguen la relevancia del tipo de solución liquida utilizada para transferir embriones equinos sobre el impacto que pudieran tener sobre el ISEPVIG. No es sabido si soluciones simples tales como la salina fisiológica o el lactato de Ringer son buenas alternativas como medios de transferencia embrionaria. No se ha investigado si el uso de solución salina o de lactado de Ringer por si solos o combinados con antibióticos resultan en ISEPVIG aceptables cuando se trabaja con embriones fenotipo burro o mula. Comparar el ISEPVIG obtenido cuando se transfieren embriones equinos usando soluciones liquidas simples y fáciles de obtener tales como la salina fisiológica o el lactato de Ringer; o más complejas tales como los medios de cultivo suplementado con suero de origen animal y/o fluido sintético de oviducto requiere más investigación. La investigación en el área de criopreservación utilizando embriones de fenotipo burro o embriones híbridos tales como mulas y burdéganos son modelos que pueden ayudar a desarrollar alternativas que resulten en una mejora de la sobrevivencia post vitrificación (calentamiento), resultando en un alto porcentaje de gestaciones post transferencia. Mas investigación es necesaria en yeguas y burras para mejorar los protocolos de vitrificación y por ende incrementar el ISEPVIG especialmente con embriones fenotipo burro y mula >300 µmØ.
